天仙子中消旋山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品的含量測定及HPLC 特征圖譜研究*

周 軍，趙 晨，張 洋，曲 佳，呂曙華

(1.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070; 2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠，天津 300457 )

天仙子是茄科植物莨菪Hyoscyamus niger L 的干燥成熟種子，為2005 年版《中國藥典》一部［1］收載的藥材，化學(xué)成分主要有生物堿、甾體化合物、脂肪油等，具有解痙止痛，安神定喘的功效。消旋山莨菪堿、東莨菪堿及阿托品是天仙子生物堿類物質(zhì)中的主要成分，既是有效成分，又是有毒成分。有文獻(xiàn)報(bào)道對天仙子中上述生物堿類成分進(jìn)行含量測定，但因?yàn)樘崛》椒┈嵑蜕V條件重現(xiàn)性較差，其含量測定方法未能載入藥典標(biāo)準(zhǔn)中。為完成《中國藥典》修訂任務(wù)，本文建立上述三種成分的含量測定方法;實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對天仙子的特征圖譜進(jìn)行了初步研究，為《中國藥典》中該品種藥材含量測定和質(zhì)量控制提供了數(shù)據(jù)和借鑒。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 高效液相色譜儀，配有在線脫氣機(jī)、四元泵、VWD 檢測器、自動進(jìn)樣器、ChemStations 色譜工作站。SIBATA 超聲波清洗器。

消旋山莨菪堿對照品(批號100249 -199501)、氫溴酸東莨菪堿對照品(批號100049 -200308)和硫酸阿托品對照品(批號100040 -200510)均購自中國藥品生物制品檢定所，含量測定用。乙腈、四氫呋喃(色譜純，天津市康科德科技有限公司)，水為去離子水，醋酸鈉、冰醋酸、三乙胺(分析純，天津市康科德科技有限公司)。試驗(yàn)用藥材來自不同產(chǎn)地，均由天津藥檢所中藥室吳貴華副主任藥師鑒定為天仙子。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為資生堂CAPCELL - PAK C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);乙腈-甲醇-醋酸鈉緩沖液(5 ∶ 5 ∶ 90)為流動相〔醋酸鈉緩沖液(含30 mmol/L 醋酸鈉，0.02%三乙胺，0.3%四氫呋喃，用冰醋酸調(diào)pH 6.0)〕;流速1.0 ml/min;檢測波長為210 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量5 μl。在此色譜條件下，精密吸取對照品溶液、供試品溶液進(jìn)樣，測定。結(jié)果消旋山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品的保留時(shí)間分別為13.4、17.0、24.8 和30.8 min;分離度均大于1.5;色譜圖見圖1;理論板數(shù)按莨菪堿峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000;樣品中其他成分對消旋山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品的測定無干擾。

2.2 對照品溶液的制備 取消旋山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿(60 ℃干燥1 h 后在105 ℃干燥3 h)、硫酸阿托品對照品(120 ℃干燥3 h)各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 分別含0.15、0.04 和0.1 mg 的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取天仙子藥材適量，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉2 g，置索氏提取器中，加石油醚(30 ～60℃)適量，加熱回流2 h，棄去石油醚液，藥渣揮干石油醚，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流6 h，提取液減壓回收至近干，殘?jiān)酉“彼芤?氨試液5 ml→25 ml)25 ml 使溶解(可用少量三氯甲烷洗滌容器及殘?jiān)?，用三氯甲烷提取5 次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，減壓回收至干，殘?jiān)訜o水乙醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml 量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 對照品(A)樣品(B)HPLC 色譜圖

2.4 線性關(guān)系的考查 取消旋山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成消旋山莨菪堿、東莨菪堿和硫酸阿托品濃度為0.2338，1.3657 和1.6812 mg/ml 的混合對照品溶液，分別精密吸取0.2、0.5、1、2.5、5 和10 ml，置25 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密量取5 μl，進(jìn)樣分析，以相應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。消旋山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品回歸方程分別為:Y= -6.1215 +1458.5 X (r=0.9999)、Y=7.5651 +1121. 9 X (r =0. 9999)和Y = -2. 2388 +1207.8 X (r=0.9999)，結(jié)果表明消旋山莨菪堿進(jìn)樣量在0. 009 35 ～0. 4676 μg、東莨菪堿在0. 054 63 ～2.7314 μg、阿托品在0.067 25 ～3.3623 μg 范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系(氫溴酸東莨菪堿折合成東莨菪堿系數(shù)為0.7894，硫酸阿托品折合成阿托品系數(shù)為0.8551)。

2.5 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計(jì)算消旋山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品峰面積的RSD 分別為3.50%、0.20%和0.20%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一天仙子藥材適量，研細(xì)，取2 g，共6 份，精密稱定，制成供試品溶液進(jìn)樣，測定3 種成分含量，6 次測定值分別為:消旋山莨菪堿0.0321 mg/g，RSD 為2.67%;東莨菪堿0.5499 mg/g，RSD 為1.51%;阿托品0.6448 mg/g，RSD 為1.41%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別在0、2、4、8、12、18 和24 h 進(jìn)樣，測定，結(jié)果消旋山莨菪堿、東莨菪堿和阿托品峰面積的RSD 分別為2.43%、0.16%和0.22%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 取消旋山莨菪堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為含消旋山莨菪堿0. 005 61 mg/ml、氫溴酸東莨菪堿0. 144 mg/ml、硫酸阿托品0.1528 mg/ml 的混合對照品溶液;精密量取混合對照品溶液5 ml 置圓底燒瓶中，減壓蒸干。取同一天仙子樣品適量，研細(xì)，精密稱取1 g，置索氏提取器中，用上述圓底燒瓶按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果山莨菪堿平均回收率為103.72%，RSD 為1.72%;東莨菪堿平均回收率為98.57%，RSD為1.64%;阿托品平均回收率為102. 96%，RSD 為1.26%。

2.9 樣品的測定 取8 個(gè)不同產(chǎn)地的天仙子藥材，按照供試品溶液制備操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表1。

3 天仙子藥材特征圖譜的建立

3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取天仙子粉末2 g，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18 和24 h 進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖，結(jié)果表明，各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均在2.4%以內(nèi)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表1 不同產(chǎn)地天仙子藥材中3 種生物堿的測定結(jié)果(n=2)

3.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取天仙子粉末2 g，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，考查各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的一致性。結(jié)果表明，各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均在2.0%以內(nèi)，表明該方法精密度良好。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一天仙子粉末6 份，各2 g，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，考查各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的一致性。結(jié)果表明，各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均在1.7%以內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4 特征圖譜共有峰的確定 分別取不同產(chǎn)地的天仙子樣品8 批，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下各取10 μl，進(jìn)樣，得到8 批樣品的HPLC 色譜圖，分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)”，選定5 號峰為marker峰，進(jìn)行譜峰匹配(匹配后的色譜圖見圖2)，通過相似度計(jì)算得出天仙子藥材特征圖譜的共有模式，得到特征圖譜(見圖3)。8 批天仙子藥材的相似度依次為1.000、0. 974、0. 972、0. 999、1. 000、1. 000、0. 993 和0.982，表明8 批藥材具有較高的相似度。

圖2 8 批樣品匹配后的HPLC 色譜圖

圖3 天仙子HPLC 特征圖譜

4 討論

4.1 提取方法的優(yōu)化 文獻(xiàn)報(bào)道［2-4］中天仙子的含量測定方法較煩瑣，提取步驟均為提取液反復(fù)堿化→酸化→三氯甲烷提取，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確定量，且三氯甲烷用量較大。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)，本文采用石油醚脫脂→甲醇提取→用氨水堿化→三氯甲烷提取的方法，大大簡化提取過程，減少溶劑用量和提取時(shí)間。因天仙子為種子類藥材，含有大量的油脂類成分，對提取及分離具有非常大的影響，故石油醚脫脂為本實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵的步驟。

4.2 流動相的選擇 實(shí)驗(yàn)中對文獻(xiàn)報(bào)道的流動相逐一進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照品及供試品中消旋山莨菪堿、東莨菪堿及阿托品均存在峰形較差的現(xiàn)象，表現(xiàn)為色譜峰不對稱、拖尾或不能有效分離上述三種成分。經(jīng)試驗(yàn)，本文采用乙腈-甲醇-醋酸鈉緩沖液(5∶ 5∶90)為流動相，供試品色譜中消旋山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品色譜峰與雜質(zhì)峰分離較好，分離度均大于1.5;采用三種不同牌子色譜柱(DIKMA，Phenomenex，CAPCELL)耐用性均較好。

4.3 流動相的優(yōu)化 取不同濃度(10、20、30 和40 mmol/L)的醋酸鈉緩沖液，進(jìn)樣，測定，結(jié)果以緩沖鹽濃度為30 mmol/L 時(shí)效果較好;取濃度為30 mmol/L的緩沖液，分別用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值為5.0、5.5、6.0、6.5 和7.0，進(jìn)樣，測定，結(jié)果以pH 值為6.0 時(shí)效果較好;對流動相中乙腈和甲醇的比例進(jìn)行考查，確定乙腈-甲醇-醋酸鈉緩沖液比例為(5∶ 5∶ 90);在流動相中添加三乙胺和四氫呋喃后可有效的改善拖尾和調(diào)節(jié)峰形。

4.4 柱溫的選擇 比較不同柱溫(30、35 和40 ℃)條件下樣品的分離情況，結(jié)果以柱溫為30 ℃樣品分離較好。

4.5 峰純度檢查 取對照品溶液和供試品溶液，使用二極管陣列檢測器，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果樣品色譜中消旋山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品色譜峰均為純色譜峰。

4.6 不同色譜柱對含量測定的影響 取重現(xiàn)性試驗(yàn)項(xiàng)下的供試品溶液，分別采用資生堂CAPCELL -PAK C18柱，phenomenex C18柱，DIKMA - Kromasil C18柱，均為(4.6 mm×250 mm，5 μm)，采用Agilent-1200 高效液相色譜儀，進(jìn)樣，測定，計(jì)算樣品中山莨菪堿、東莨菪堿及阿托品的總量。結(jié)果上述3 種色譜柱測定結(jié)果基本一致，說明不同色譜柱對樣品的含量測定結(jié)果無明顯影響。

4.7 從收集的8 個(gè)產(chǎn)地藥材測定結(jié)果分析，天仙子藥材中消旋山莨菪堿的量較低，平均為0.018%，約占生物堿總量(1. 05%)的1. 7%;東莨菪堿的量平均為0.43%，約占生物堿總量(1.05%)的41%;阿托品的量平均為0.61%，約占生物堿總量(1.05%)的58%。各地藥材中總生物堿含量為0.8437 ～1.2701%，基本在平均含量(1.05%)的80% ～120%范圍內(nèi)。本含量測定方法已被《中國藥典》2010 年版收錄，因消旋山莨菪堿量所占總生物堿比例較低，約為1.9%，因此未將其列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。

4.8 特征圖譜 本實(shí)驗(yàn)采用RP -HPLC 法對天仙子進(jìn)行分析，由生成的特征圖譜可以看出不同產(chǎn)地的天仙子藥材特征圖譜中主要色譜峰的整體圖貌基本一致，均具有相同的色譜特征峰。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A，2004B)”可以很好的對天仙子藥材特征圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，對鑒別藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣有重要的參考價(jià)值。

1 中國藥典［S］.一部.2005:37

2 馬翠英，陳德昌，楊兆起. 反相離子對HPLC 法測定天仙子中的生物堿及TLC 法鑒別天仙子和南天仙子［J］. 藥物分析雜志，1996，16(2):119

3 王環(huán)，潘莉，張曉峰.HPLC 法測定天仙子和馬尿泡中3 種托烷類生物堿的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2002，17(1):9

4 邢桂菊，尹松鶴.高效液相色譜法測定天仙子中莨菪堿及東莨菪堿的含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26(2):236