姜黃素衍生物T83 對同源不同輻射抗性鼻咽癌細胞凋亡的作用*

王夢瑤， 王蘇美， 左應林， 王杜娟， 劉 琴， 王春華， 卜憲章， 楊惠玲△

(1中山大學中山醫(yī)學院病理生理學教研室，廣東 廣州510080;2中山大學藥學院，廣東 廣州510275)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)高發(fā)于中國南方地區(qū)，具有明顯的地區(qū)性和家族聚集性［1］。放療為鼻咽癌的首選療法，但由于放療耐受等導致30% ～40%病人發(fā)生局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，嚴重影響放療病人的預后［2］，因此尋找可抑制鼻咽癌細胞活性且逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的小分子化合物，是提高鼻咽癌病人5 年生存率的關鍵。本課題組卜憲章等合成的4-芳甲叉類等姜黃素衍生物，初篩結(jié)果顯示其具有廣譜抗癌活性，其中包括對CNE-2 細胞生長的抑制作用［3］，而4-芳甲叉類姜黃素衍生物T83 是否具有逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的作用尚未見報道。本實驗擬采用MTT 法、Hoechst 33342 染色法結(jié)合熒光顯微鏡、流式細胞術、Western blotting 和qRT-PCR 方法檢測和比較T83 對本實驗室構(gòu)建的同源不同輻射抗拒的鼻咽癌細胞CNE-2R［4］和CNE-2 細胞活力、細胞凋亡及線粒體膜電位、線粒體凋亡通路相關凋亡蛋白和細胞PTEN/Akt/p27 mRNA 水平等的影響，以闡明T83 抑制鼻咽癌細胞活性且逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的作用及信號轉(zhuǎn)導通路，為逆轉(zhuǎn)鼻咽癌輻射抗拒的治療提供新靶點和潛在抗癌制劑。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞 低分化鼻咽癌細胞株CNE-2 購自中山大學實驗動物中心;鼻咽癌輻射抗拒細胞株CNE-2R為本實驗室構(gòu)建。

1.2 藥物及實驗試劑 T83 由中山大學藥學院卜憲章實驗室合成。RPMI-1640 培養(yǎng)基購自Gibco;新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑鹽［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT］、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和羅丹明123(rhodamine 123，Rh123)均購自Sigma;Hoechst 33342 購自Life Technologies;膜連蛋白V(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細胞凋亡檢測試劑盒購自羅氏公司;procaspase-3、細胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)鼠抗人單克隆抗體和HRP 標記的羊抗鼠IgG 均購自Cell Signaling Technologies;procaspase-9 鼠抗人單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology;β-actin 鼠抗人單克隆抗體購自Sigma;Trizol reagent 購自Invitrogen。

1.3 實驗儀器 SUNRISE 全自動酶標儀購自Tecan;IX71 倒置熒光顯微鏡購自Olympus;流式細胞儀購自Becton Dickinson;分光光度計購自Thermo。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) CNE-2R 和CNE-2 細胞用含10%新生牛血清、青-鏈霉素的RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 MTT 法檢測鼻咽癌細胞的活性 用胰酶(2.5 g/L)消化對數(shù)生長期細胞，接種于96 孔板(密度為3 ×103cells/well)，每孔200 μL。貼壁12 h，實驗組各孔分別加入藥物200 μL，T83 終濃度為0.05、0.15、0.3、0.5 和0.7 μmol/L，對照組加入含0.2%DMSO 的培養(yǎng)基200 μL/well，空白組加入培養(yǎng)基200 μL/well，每組設8 孔，重復3 次。藥物作用24、48 和72 h 后，加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，在37 ℃、5%CO2條件下孵育3.5 h。吸出各孔中液體，加入150 μL DMSO，振蕩5 ～10 min 使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀波長為570 nm 處測量各孔的吸光度(A)值。細胞生存率(%)=A處理組/(A處理組-A空白組)×100%。

2.3 Hoechst 33342 染色結(jié)合熒光顯微鏡觀測鼻咽癌細胞凋亡的形態(tài) 接種細胞于6 孔板(密度為2 ×105cells/well)，0.3 和0.6 μmol/L T83 作用48 h 后，PBS 洗2 遍，用甲醇固定20 min 后Hoechst 33342 染色15 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 Annexin Ⅴ/碘化丙啶( propidium iodide，PI) 雙染色結(jié)合流式細胞儀檢測鼻咽癌細胞的凋亡 接種細胞于6 孔板(密度為2 ×105cells/well)，0.1、0.2 和0.4 μmol/L T83 作用48 h 后，用無EDTA 胰酶消化收集細胞，PBS 洗2 遍離心棄上清，用Annexin Ⅴ/PI雙染色標記法檢測細胞凋亡百分率。

2.5 Rh123 染色結(jié)合流式細胞術檢測鼻咽癌細胞的線粒體膜電位 接種細胞于6 孔板(密度為2 ×105cells/well)，0.4 和0.8 μmol/LT83 作用36 h 后，用無EDTA 胰酶消化收集細胞，PBS 洗2 遍離心棄上清，將細胞重懸于0.2 mL 的5 g/L Rh123 染液中，37℃避光染色30 min，用流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位。

2.6 Western blotting 法檢測鼻咽癌細胞procaspase-3/procaspase-9/Cyt-C 的蛋白表達水平 0.2、0.4 和0.8 μmol/L T83 作用48 h 后，收集全蛋白細胞蛋白標本，常規(guī)BCA 方法蛋白定量。制備15%聚丙烯酰胺凝膠，進行SDS-PAGE 電泳(1. 5 ～2 h)，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜(60 min)，室溫5%BSA 封閉1 h，加Ⅰ抗孵育PVDF 膜4 ℃過夜，TBST 洗膜3 次，加Ⅱ抗孵育60 min，TBST 洗膜3 次，ECL 發(fā)光液顯色曝光，Quantity One 軟件分析結(jié)果，以β-actin 為內(nèi)參照。

2.7 qRT-PCR 檢測鼻咽癌細胞PTEN/Akt/p27 的mRNA 水平 0.2 和0.4 μmol/L T83 作用24 h 后，用Trizol 提取總RNA 并用分光光度計檢測其RNA的純度和濃度。按照Invitrogen 公司的qRT-PCR 試劑盒說明書，進行RNA 反轉(zhuǎn)錄和擴增，2-ΔΔCt方法進行實時定量檢測分析，以β-actin 為內(nèi)參照。PTEN 的引物:正義鏈5'-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3'，反義鏈5'-TTTGGCGGTGTCATAATGTCTT-3';Akt 的引物:正義鏈5'-TCTTTGCCGGTATCGTGT-3'，反義鏈5'-TGTCATCTTGGTCAGGTGGT-3';P27 的引物:正義鏈5'-CGAGATCTGATGTCAAACGTGCGAGT-3'，反義鏈5'-CTGAATTCTTGACGTCTTCTGAGGCC-3'。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0 進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean ±SD)或均數(shù)±標準誤(mean ±SEM)表示，連續(xù)型數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，離散型數(shù)據(jù)的組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 T83 對NPC 細胞活性的影響

T83 作用24、48 和72 h 后，NPC 細胞的存活率見表1。采用IC50軟件統(tǒng)計得到T83 作用于CNE-2R 細胞的IC50分別為0.90、0.40 和0.20 μmol/L，作用于CNE-2 細胞的IC50分別為1.80、0.50 和0.40 μmol/L，T83 對CNE-2R 細胞活性抑制作用明顯于CNE-2 細胞，且對2 種細胞均呈劑量時間依賴性。

表1 T83 對CNE-2R 和CNE-2 細胞活性的影響Table 1. Effect of T83 on the viability of CNE-2R and CNE-2 cells (%.Mean±SEM. n=3)

2 T83 對NPC 細胞凋亡形態(tài)的影響

Hoechst 33342 染色結(jié)果顯示，T83 作用48 h 后可使NPC 細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學改變。隨著藥物濃度的升高細胞核體積明顯減小，核形態(tài)發(fā)生變化，如染色質(zhì)濃縮、邊集和染色質(zhì)分割成塊狀;對照組細胞核形態(tài)完整，見圖1。

Figure 1. Effects of T83 on the apoptotic morphology of CNE-2R and CNE-2 cells (Hoechst 33342 staining，× 200;magnification in the upper right images，×400).圖1 T83 對CNE-2 和CNE-2R 細胞凋亡形態(tài)的影響

3 T83 對NPC 細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結(jié)果見圖2、3，T83 作用48 h 對CNE-2R 和CNE-2 細胞具有劑量依賴性地誘導凋亡的作用，并以晚期凋亡為主。高劑量組中，CNE-2R細胞的晚期凋亡率為27.26%，明顯高于CNE-2 細胞的8.15%，差異顯著，說明T83 可較特異地加速CNE-2R 細胞凋亡。

4 T83 對NPC 細胞線粒體膜電位的影響

流式細胞術檢測結(jié)果見圖4，T83 作用36 h 可誘導CNE-2R 和CNE-2 細胞線粒體膜電位下降且呈劑量依賴性。0.4 和0.8 μmol/L T83 使CNE-2R 細胞線粒體膜電位下降率分別為56. 08% 和87. 71%，CNE-2 細胞分別為20.48%和50.47%;2 株細胞處理組和對照組比差異顯著;在相同藥物濃度下2 株細胞的線粒體膜電位降低率差異顯著。

Figure 2. Effects of T83 on the apoptosis of CNE-2R and CNE-2 cells.Upper right:late apoptosis;lower right:early apoptosis;lower left:viable cell.圖2 T83 對CNE-2R 和CNE-2 細胞凋亡的影響

Figure 3. Effects of T83 on the late apoptotic rates of CNE-2R and CNE-2 cells. Mean ± SD. n = 3. * P ＜0. 05，＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖3 T83 對CNE-2R 和CNE-2 細胞晚期凋亡的影響

5 T83 對NPC 細胞procaspase-3/procaspase-9/Cyt-C 蛋白表達的影響

Western blotting 檢測結(jié)果見圖5，T83 作用48 h后，CNE-2R 和CNE-2 細胞中procaspase-3 和procaspase-9 蛋白表達水平呈劑量依賴性降低，且在CNE-2R 細胞中更加顯著;Cyt-C 蛋白表達水平呈劑量依賴性升高，且低劑量組中，CNE-2R 細胞的Cyt-C蛋白表達已有明顯升高。

6 T83 對NPC 細胞PTEN/Akt/p27mRNA 的影響

qRT-PCR 檢測結(jié)果見圖6 ～8，T83 作用24 h 后，CNE-2R 和CNE-2 細胞中PTEN 和p27 mRNA 水平呈劑量依賴性升高，且在CNE-2R 細胞中T83 濃度為0.4 μmol/L 時兩者的mRNA 水平顯著升高;在2 株細胞中Akt mRNA 水平呈劑量依賴性降低，處理組與對照組相比差異顯著。

討 論

大量研究證明姜黃素衍生物利用度低和代謝速度快等缺點限制其在抗癌治療中的應用［5］，近年來結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且抗癌活性更加顯著的姜黃素衍生物對腫瘤細胞作用的研究已成為研究者關注的焦點［5-6］，但各類衍生物的抗癌活性和作用機制不相同［7］。我們已合成一系列姜黃素衍生物，同時研究結(jié)果顯示4-芳甲叉類姜黃素衍生物具有廣譜抗癌活性，通過抑制NF-κB 和Akt 通路活性而抑制肺癌細胞的生長［3］，但姜黃素衍生物是否具有逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的作用尚未見報道。我們的研究結(jié)果首次揭示T83 可較特異抑制輻射抗拒鼻咽癌細胞的活性，且具有時間劑量依賴性。雖然本研究結(jié)果與本實驗室報道的單羰基姜黃素衍生物B50 和B67［5，8］的作用相似，但與B50 和B67 作用CNE-2R 和CNE-2 細胞24、48 和72 h 后的IC50(B50:8.06、2.49 和1.42 μmol/L，8.18、3.00 和1.75 μmol/L;B67:3.96、2.59 和0.89 μmol/L，8.84、3.55 和1.10 μmol/L)比，T83 的IC50明顯降低(0.90、0.40 和0.20 μmol/L，1.80、0.50 和0.40 μmol/L)，這表明T83 較其它類姜黃素衍生物具有更強的抗癌活性和更好的逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的作用，提示T83 是一種更具有逆轉(zhuǎn)鼻咽癌輻射抗拒的潛在抗癌制劑。

Figure 4. Effects of T83 on mitochondrial membrane potential of CNE-2R and CNE-2 cells.圖4 T83 對CNE-2R 和CNE-2 細胞線粒體膜電位的影響

Figure 5. Effects of T83 on procaspase-3，procaspase-9 and Cyt-C protein expression in CNE-2R and CNE-2 cells.圖5 T83 對CNE-2R 和CNE-2 細胞procaspase-3，procaspase-9，Cyt-C 蛋白表達的影響

Figure 6. Effect of T83 on PTEN mRNA expression in CNE-2R and CNE-2 cells. Mean ± SD. n =3. ＊＊P ＜ 0. 01 vs 0 μmol/L.圖6 T83 對CNE-2R 和CNE-2 細胞PTEN mRNA 的影響

Figure 7. Effect of T83 on Akt mRNA expression in CNE-2R and CNE-2 cells.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖7 T83 對CNE-R2 和CNE-2 細胞Akt mRNA 的影響

Figure 8. Effect of T83 on p27 mRNA expression in CNE-2R and CNE-2 cells. Mean ± SD. n =3. ＊＊P ＜ 0. 01 vs 0 μmol/L.圖8 T83 對CNE-2R 和CNE-2 細胞p27 mRNA 的影響

為闡明T83 對鼻咽癌細胞作用的細胞機制，我們通過熒光顯微鏡和流式細胞術觀察鼻咽癌細胞形態(tài)學變化和檢測細胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T83 作用48 h 后CNE-2R 和CNE-2 細胞出現(xiàn)明顯染色質(zhì)濃集、邊集和染色質(zhì)分割成塊狀等凋亡形態(tài)學改變;T83 作用48 h 后CNE-2R 和CNE-2 細胞凋亡率明顯升高，以晚期凋亡為主，且以CNE-2R 細胞更為顯著。同時我們通過流式細胞術檢測T83 作用后2 株細胞的線粒體膜電位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNE-2R 和CNE-2 細胞的線粒體膜電位顯著下降，呈劑量依賴性，且以前者更為顯著。進一步我們通過Western blotting 檢測T83 作用后2 株細胞內(nèi)線粒體凋亡途徑相關蛋白表達的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNE-2R 和CNE-2 細胞中procaspase-3和procaspase-9 蛋白水平降低，且在CNE-2R 細胞中更加顯著;低劑量T83 即可誘導CNR-2R 細胞線粒體釋放Cyt-C，引起Cyt-C 表達水平升高。這些結(jié)果與Wang 等［9］和Ren 等［10］的報道相似，我們認為T83 作用于CNE-2R 和CNE-2 細胞36 h 后，首先引起線粒體膜電位的下降，T83 作用48 h 時才出現(xiàn)明顯的細胞凋亡形態(tài)和百分率的升高，因此說明線粒體膜電位的下降是凋亡的早期表現(xiàn)，一旦線粒體膜電位損耗，通過釋放Cyt-C 等促凋亡蛋白，引起procaspase-9 的活化，進而激活其下游的procaspase-3 導致細胞進入不可逆的凋亡過程;同時說明T83 通過較特異地啟動線粒體凋亡途徑而誘導輻射抗拒鼻咽癌細胞凋亡。

大量研究報道了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及PTEN/Akt/p27 信號轉(zhuǎn)導通路的激活［11-12］。為進一步探討T83 作用的分子機制，我們利用qRT-PCR 法檢測PTEN/Akt/p27 mRNA 表達量，結(jié)果顯示T83 作用24h 后，CNE-2R 和CNE-2 細胞中PTEN 和p27 mRNA 的表達明顯增加，而Akt mRNA 的表達明顯降低，呈劑量依賴性，且以前者更加顯著。這提示T83加速鼻咽癌細胞凋亡可能通過抑制PTEN/Akt/p27信號轉(zhuǎn)導通路mRNA 水平，至于T83 是否影響該通路的蛋白水平有待進一步探討。

綜上所述，T83 通過較特異地調(diào)控PTEN/Akt/p27 信號轉(zhuǎn)導通路，通過啟動線粒體凋亡途徑加速凋亡而較特異地抑制輻射抗拒鼻咽癌細胞的活性，為逆轉(zhuǎn)鼻咽癌輻射抗拒的治療提供新靶點和潛在抗癌制劑。

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