Neuregulin-1β 對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥大大鼠治療作用及機(jī)制的研究

劉延峰， 劉小娟， 惠起源△

(1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2延安市衛(wèi)生學(xué)校，陜西 延安716000)

心肌肥大(myocardial hypertrophy)是心肌細(xì)胞對(duì)持續(xù)負(fù)荷增加的一種適應(yīng)性反應(yīng)。高血壓性心肌肥大是充血性心力衰竭重要的誘因及獨(dú)立危險(xiǎn)因子，初期具有一定的代償意義，但在體循環(huán)高負(fù)荷長(zhǎng)期存在時(shí)，心肌會(huì)發(fā)生失代償，最終可導(dǎo)致心力衰竭。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β(neuregulin-1β，NRG-1β)是一種調(diào)節(jié)和保護(hù)性生長(zhǎng)因子，因其首先在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)而得名。在成年心臟中，NRG-1β 特異性地在心肌內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，心肌細(xì)胞并不表達(dá)NRG-1β;而其受體ErbB2 在心肌細(xì)胞中卻有表達(dá)［1-2］。因此，靠近心肌細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放NRG-1β，通過旁分泌作用于心肌細(xì)胞中的受體。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1β/ErbBs 信號(hào)系統(tǒng)不僅參與心肌細(xì)胞和心臟胚胎發(fā)育的分化調(diào)控，與成體心臟功能、心衰的發(fā)生、發(fā)展乃致預(yù)后等病理過程也密切相關(guān)。本研究以腹主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致壓力超負(fù)荷心肌肥大大鼠為對(duì)象，通過外源性給予NRG-1β，觀察NRG-1β 對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥大大鼠心肌AngII 和TNF-α 表達(dá)的影響，以及NRG-1β 對(duì)bcl-2 和bax 表達(dá)水平的影響，探討在體條件下NRG-1β 對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥大大鼠的治療作用及相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

雄性Wistar 大鼠48 只，體重220 ～280 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 材料

NRG-1β 購于以色列的Prospec-Tany Techno-Gene Ltd。ErbB2 受體拮抗劑赫賽汀(herceptin，HERCE)購自武漢日升科技發(fā)展有限公司。

3 方法

3.1 壓力超負(fù)荷大鼠模型的建立 成年健康雄性Wistar 大鼠，體重為220 ～280 g，隨機(jī)分為4 組，每組12 只。(1)腹主動(dòng)脈縮窄(model)組:戊巴比妥鈉(15 mg/kg)腹腔注射麻醉后，于左腎動(dòng)脈上方小心分離約3 mm 長(zhǎng)的腹主動(dòng)脈，套以內(nèi)徑為0.8 mm 銀夾縮窄腹主動(dòng)脈，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。(2)假手術(shù)(sham)組:除不以銀夾縮窄腹主動(dòng)脈外，其余操作同腹主動(dòng)脈縮窄組。(3)NRG-1β 干預(yù)組:腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后8 周給予NRG-1β 尾靜脈注射，10 μg·kg-1·d-1，共7 d。(4)NRG-1β +HERCE 干預(yù)組:大鼠除相同方法注射NRG-1β 外，尾靜脈注射ErbB2 受體拮抗劑HERCE 10 μg·kg-1·d-1，共7 d。假手術(shù)組和腹主動(dòng)脈縮窄組給予同等劑量的生理鹽水，尾靜脈注射，共7 d。給藥期間常規(guī)飼養(yǎng)。給藥結(jié)束后，測(cè)量各組動(dòng)物體重及血壓，并進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定。

3.2 超聲心動(dòng)圖( echocardiography) 測(cè)定 戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，用HP Sonos 2500 型多功能超聲檢查儀及7.5 MHz 相控陣探頭(美國惠普公司)檢測(cè)左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)等指標(biāo)并計(jì)算出左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

3.3 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 麻醉同上，分離右側(cè)頸動(dòng)脈，將導(dǎo)管插入頸動(dòng)脈送至主動(dòng)脈，然后進(jìn)一步將導(dǎo)管送入左心室。導(dǎo)管通過壓力傳感器與泰盟BL-420F 多導(dǎo)生理監(jiān)護(hù)儀連接，記錄左室收縮末壓(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室內(nèi)壓最大上升、下降速率(maximal rate of increase/decrease in left ventricular pressure，± dp/dtmax)等指標(biāo)。

3.4 心肌肥大指數(shù)的測(cè)定 各組動(dòng)物摘取心臟。測(cè)量全心重、左心室重(包括左心室游離壁和室間膈)，計(jì)算心室重與體重比值(V/Bwt，Hermann Wilson’s 公式)作為心肌肥大指數(shù)。

3.5 左心室肌組織血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)含量測(cè)定 取左心室肌組織約500 mg，剪碎，加入3 mL 0.1 mol/L 醋酸置于玻璃勻漿器制備組織勻漿，上述操作均在冰浴中進(jìn)行。心肌勻漿10 000 ×g 離心20 min，上清液以放射免疫法(放射免疫試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供)測(cè)定Ang II 含量。

3.6 左心室肌組織腫瘤壞死因子α ( tumor necrosis factor α，TNF-α) 含量的測(cè)定 取左心室肌組織約500 mg，剪碎，加入3 mL 冰凍生理鹽水于玻璃勻漿器制備組織勻漿，13 000 ×g 離心10 min。取上清液以酶聯(lián)免疫吸附法(酶聯(lián)免疫試劑盒北京北方生物技術(shù)研究所提供)測(cè)定TNF-α 含量。

3.7 Masson 膠原特殊染色及膠原容積分?jǐn)?shù)( collagen volume fraction，CVF) 的測(cè)定 常規(guī)石蠟切片脫蠟，采用Masson 染色，逐級(jí)乙醇脫水，中性樹脂包埋，鏡下觀察并攝片。采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量CVF，CVF=膠原面積/總面積，每張切片均隨機(jī)取3 個(gè)視野測(cè)量，計(jì)算其均值。

3.8 RT-PCR 法測(cè)定bcl-2 和bax mRNA 表達(dá)的變化 Trizol 法提取心肌組織中的總RNA，測(cè)定總RNA純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)說明書，取2 μg總RNA 樣本在10 μL 體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取cDNA 2.5 μL 參照說明書(大連寶生物工程有限公司)在25 μL 體系中擴(kuò)增。引物序列為:bcl-2 (NM-016787):上游引物5’-CGGGAGATCGTGATGAAGT-3’，下游引物5’-CCACCGAACTCAAAGAAGG-3’;bax(NM-017059):上游引物5’-GCAGGGAGGATGGCTGGGGAGA-3’，下游引物5’-TCCAGACAAGCAGCCGCTCACG-3’;GAPDH(NM-017008):上游引物5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’，下游引 物5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’。以上引物由北京奧科生物公司提供。反應(yīng)條件為:95 ℃30 s、55℃30 s、72 ℃1 min，共循環(huán)35 次，72 ℃8 min。PCR產(chǎn)物最好于24 h 內(nèi)進(jìn)行電泳。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中成像并計(jì)算條帶中熒光的強(qiáng)度?；虻谋磉_(dá)程度由樣本中的PCR 產(chǎn)物條帶的熒光程度與同一樣本中GAPDH 的PCR 產(chǎn)物條帶的熒光強(qiáng)度相比較而得出。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK 法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物模型的建立

各組大鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)進(jìn)行血壓的測(cè)定，sham 組為(116.72 ±6.71)mmHg，model 組為(178.24 ±9.22)mmHg，NRG-1β 組為(133.04 ±12.13)mmHg，NRG-1β+ HERCE 組為(167. 31 ±11. 24)mmHg，其中，model 組血壓較sham 組明顯升高(P ＜0.01);V/Bwt的測(cè)定中，model 組(2.89 ±0.34)較sham 組(2.04 ±0.07)明顯升高(P ＜0.01)，以上結(jié)果說明造模成功。NRG-1β 組血壓及V/Bwt 較model 組顯著下降(P ＜0.01)，而NRG-1β + HERCE 的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了這種改變，使血壓維持在高水平。

2 超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的比較

與sham 組相比，model 組的LVEF 和LVFS 明顯降低(P ＜0.01)，而LVEDD 和LVESD 明顯增大(P ＜0.01);與model 組相比，NRG-1β 組的LVEF和LVFS 明顯升高(P ＜0.01)，LVEDD 和LVESD 明顯下降(P ＜0.01);而NRG-1β + HERCE 組大鼠與sham 組及NRG-1β 組相比，LVEF 和LVFS 降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，LVESD 和LVEDD 增高(P ＜0.01)，與model 組相比無明顯變化，見圖1。

3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較

與sham 組相比，model 組的±dp/dtmax和LVESP明顯降低(P ＜0.01)，LVEDP 明顯升高(P ＜0.01);與model 組相比，NRG-1β 組±dp/dtmax和LVESP 明顯升高(P ＜0.01)，LVEDP 明顯降低(P ＜0.05);而NRG-1β+HERCE 組與sham 組及NRG-1β 組相比，±dp/dtmax和LVESP 明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，LVEDP 明顯升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，與model 組無明顯差異，見圖2。

Figure 1. The values of LVESD，LVEDD，LVEF and LVFS in the four groups. A:the changes of LVESD and LVEDD;B:the changes of LVEF and LVFS.Mean±SD.n=6. ＊＊P ＜0.01 vs sham;##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs NRG-1β.圖1 各組大鼠LVESD、LVEDD、LVEF 和LVFS 的變化

Figure 2. The values of LVESP，LVEDP and ±dp/dtmax in the four groups. A:the changes of LVESP and LVEDP;B:the changes of±dp/dtmax.Mean±SD.n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham;# P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05 vs NRG-1β.圖2 各組大鼠LVESP、LVEDP 和±dp/dtmax的變化

4 術(shù)后各組心肌Ang II 和TNF-α 的變化

如圖3 所示，與sham 組相比，model 組的Ang II和TNF-α 均明顯升高(P ＜0. 01);NRG-1β 組較model 組的Ang II 和TNF-α 均顯著降低(P ＜0.01)，而NRG-1β+HERCE 組較sham 組及NRG-1β 組Ang II 和TNF-α 均升高(P ＜0.01)。

Figure 3. The concentrations of Ang II and TNF-α in myocardium in the four groups. Mean ±SD. n =6. ＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs NRG-1β.圖3 各組大鼠心肌Ang II 和TNF-α 的變化

5 心肌組織膠原含量及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)的變化

光鏡下膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色。正常大鼠心肌血管周圍、細(xì)胞之間有少量的膠原纖維存在，形似蜂窩。Model 組心肌膠原纖維含量較sham 組明顯增加(P ＜0.01)，分布彌散，排列紊亂。NRG-1β 組CVF 較model 組顯著下降(P ＜0.01)，而NRG-1β+HERCE 組CVF 較sham 組及NRG-1β 組均升高(P ＜0.01，P ＜0.05 )，見圖4。

6 各組bcl-2 和bax mRNA 表達(dá)的變化

如圖5 所示，與sham 組相比，model 組大鼠心肌中bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯下降(P ＜0.01)，而bax mRNA表達(dá)增高(P ＜0.01);NRG-1β 組較model 組的Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著升高(P ＜0.01)，而Bax mRNA 表達(dá)下降(P ＜0.01);NRG-1β +HERCE 組與sham 組及NRG-1β 組比較，大鼠心肌中Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著下降(P ＜0.05)，Bax mRNA 表達(dá)增高(P ＜0.01)。

Figure 4. Fibrotic infiltration in myocardium (Masson’s trichrome staining，× 400). Red color shows cardiac myocytes and blue color shows collagen.Mean±SD.n=6. ＊＊P ＜0.01 vs sham;##P ＜0.01 vs model;△△P＜0.01 vs NRG-1β.圖4 Masson 染色法測(cè)定心肌膠原含量

Figure 5. Expression of bal-2 and bax mRNA in myocardium detected by RT-PCR. Mean ±SD. n =6. ＊＊P ＜0.01 vs sham;##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05;△△P ＜0.01 vs NRG-1β.圖5 RT-PCR 法檢測(cè)心肌組織中Bal-2 和Bax mRNA 的表達(dá)水平

討 論

心肌肥大是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的病理過程［4］。心肌肥大的早期因心室壁增厚，心肌收縮功能改善而被視為代償性過程。但是，在持久病理性應(yīng)激情況下，心肌肥大伴隨著間質(zhì)纖維化、收縮功能失調(diào)以及基因表達(dá)、能量代謝和電生理特征的異常，最終導(dǎo)致了失代償性的心功能衰竭。多種因素可刺激心肌肥大的產(chǎn)生，如容量及壓力負(fù)荷的加大、氧化應(yīng)激、機(jī)械牽拉及炎癥等［3］。本研究通過腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制備大鼠壓力超負(fù)荷性心肌肥大模型，探討NRG-1β 對(duì)持續(xù)壓力超負(fù)荷所致心肌肥大的治療作用及機(jī)制。

NRG-1 由1 400 kb 的基因編碼，其通過幾種啟動(dòng)子和選擇性剪切能表達(dá)出3 種不同的NRG-1 蛋白亞型［5］，其中Ⅰ型是心臟中最重要的類型。研究發(fā)現(xiàn)［6］，在糖尿病心肌病中，NRG-1β 表達(dá)顯著下調(diào)，參與了糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展。另外，NRG-1β 能降低糖尿病大鼠心肌間質(zhì)纖維化及細(xì)胞凋亡，這些作用與其上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax 和caspase-3 表達(dá)有關(guān)［7］。NRG-1 通過ErbB2、ErbB3 和ErbB4 這3 種受體在心臟發(fā)育過程中起作用。大量研究表明，NRG-1β/ ErbBs 信號(hào)系統(tǒng)在很多方面起著重要的調(diào)節(jié)作用，如促進(jìn)培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞肌節(jié)結(jié)構(gòu)的正?；?，通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)在心肌肥大中調(diào)節(jié)肌小節(jié)的合成和排列［8］。NRG-1β 基因條件性敲除小鼠表現(xiàn)為擴(kuò)張型心肌病［9］，而ErbB2 基因敲除小鼠也表現(xiàn)為心室壁變薄、心室腔擴(kuò)張、收縮力下降等擴(kuò)張型心肌病的病理變化［10］。研究顯示［11］用阿霉素誘導(dǎo)培養(yǎng)的成年大鼠心肌細(xì)胞，細(xì)胞肌絲排列紊亂，用NRG-1(10 μg/L)孵育后，排列紊亂顯著減輕，研究證明是由于激活了成年大鼠心肌細(xì)胞的ErbB2受體。因此，NRG-1β/ErbBs 信號(hào)系統(tǒng)成為心血管疾病的一個(gè)重要的潛在治療靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥大模型。與假手術(shù)組相比，模型組的血壓、LVEDD 和LVESD 明顯增大，LVEF 和LVFS 明顯降低，提示模型制備成功。外源性給予NRG-1β 治療后，大鼠的血壓、LVEDD 和LVESD 明顯減小，LVEF和LVFS 明顯升高。 ±dp/dtmax是反映左室收縮、舒張功能的主要指標(biāo)，本研究中，NRG-1β 組的±dp/dtmax較模型組明顯升高，LVEDP 降低，表明NRG-1β靜脈注射能改善心臟功能。采用Masson 法觀察大鼠心肌膠原的變化，模型組CVF 明顯升高，而NRG-1β 的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了這一變化。以上結(jié)果提示，應(yīng)用NRG-1β 后，血流動(dòng)力學(xué)得到了改善，心肌膠原分泌減少，進(jìn)而提高了整體心肌肥大大鼠的心功能。作為NRG-1β 受體ErbB2 的阻斷劑，HERCE 在本實(shí)驗(yàn)中被用于進(jìn)一步觀察NRG-1β 的作用，結(jié)果顯示，HERCE 干預(yù)后，NRG-1β 改善心肌功能的作用消失，以上各指標(biāo)與模型組相比均無明顯變化。提示，NRG-1β 通過它的受體ErbB2 在心肌肥大中發(fā)揮著重要作用。

NRG-1β 的合成與表達(dá)受許多神經(jīng)-體液因素影響。對(duì)NRG-1β 處理的成年大鼠心室肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1β 能通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)通路，激活內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelialnitric oxide synthase，eNOS)，增加一氧化氮(nitric oxide，NO)的產(chǎn)生，激活蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)，促使受磷蛋白磷酸化，提高肌漿網(wǎng)鈣泵的活性，增強(qiáng)舒張期肌漿網(wǎng)鈣的回?cái)z，從而改善心肌收縮和舒張功能［12］。在糖尿病心肌病中，NRG-1β表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)心臟內(nèi)皮素-1 的表達(dá)、氧化應(yīng)激及活性氧產(chǎn)物增加［13］，這些因素可提高內(nèi)皮細(xì)胞NRG-1 的表達(dá)［14］。另外，高糖引起的去甲腎上腺素和Ang II 分泌增多，又可抑制NRG-1β 的表達(dá)。在慢性心衰進(jìn)展的不同階段，AngII 和腎上腺素的改變也可導(dǎo)致心臟NRG-1β/ErbBs 系統(tǒng)發(fā)生不同變化。這些證據(jù)表明，NRG-1β 的作用與體內(nèi)的眾多體液因素的調(diào)節(jié)有關(guān)。心肌肥大的具體機(jī)制雖未明確，但細(xì)胞因子的增多及炎癥細(xì)胞的浸潤在心肌肥大中的作用已確立，其中Ang II 及其相關(guān)的多條信號(hào)通路發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究顯示，心肌內(nèi)源性TNF-α 在慢性壓力超負(fù)荷性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用，而腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活是心肌中TNF-α 表達(dá)上調(diào)的重要調(diào)控因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組的Ang II 及TNF-α 明顯增高，NRG-1β 抑制了這一反應(yīng)，而HERCE 的使用逆轉(zhuǎn)了NRG-1β 的抑制作用，提示NRG-1β 與其受體相互作用，可降低壓力超負(fù)荷大鼠心肌中Ang II 及TNF-α 的過表達(dá)，進(jìn)而減輕由Ang II 及TNF-α 誘導(dǎo)的心肌間質(zhì)重構(gòu)，從而在心肌肥大過程中發(fā)揮改善心肌功能的作用。

NRG-1 可通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/ERK、PI3K/Akt、Src/黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、NO 合酶(NO synthase)等多種信號(hào)通路發(fā)揮作用，參與細(xì)胞分化、增殖與凋亡調(diào)節(jié)［15-16］。于水等［8］用硫化氫處理缺血/再灌注離體心臟，能明顯減輕心肌收縮和舒張功能障礙，而PI3K/Akt 信號(hào)通路參與了硫化氫處理的心肌保護(hù)。有報(bào)道提出，Akt 誘導(dǎo)的Bcl-2 家族表達(dá)變化可能參與NRG-1β 的心肌保護(hù)機(jī)制。本研究證實(shí)，NRG-1β 可增加心肌肥大組Bcl-2 的表達(dá)，而Bax 的表達(dá)降低。Bcl-2 位于線粒體膜，可促進(jìn)細(xì)胞生存，抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)而改善肥大心肌的心功能。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，NRG-1β/ErbBs 信號(hào)系統(tǒng)在壓力超負(fù)荷型心肌肥大中發(fā)揮著重要作用，外源性給予NRG-1β 能降低壓力超負(fù)荷心肌肥大大鼠心肌中Ang II 及TNF-α 的過表達(dá)，進(jìn)而減輕了由Ang II 及TNF-α 介導(dǎo)的心肌重構(gòu);NRG-1β 誘導(dǎo)肥大心肌bcl-2 mRNA 的表達(dá)增加，bax mRNA 的表達(dá)減少，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕纖維化，改善心肌功能。這為心肌肥大的治療提供了新的思路。

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