干擾素誘導(dǎo)蛋白16 對人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖與遷移的影響及其機制*

黃 晶， 宋 方， 龍向淑， 吳 強

(貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽550002)

血管重構(gòu)是冠狀動脈介入治療術(shù)后再狹窄和高血壓等血管增殖性疾病的主要病理生理機制。既往認(rèn)為血管外膜成纖維細(xì)胞(vascular adventitial fibroblasts，VAFs)在血管重構(gòu)過程中作為“旁觀者”，僅僅起著支持與營養(yǎng)的作用。但近年來，越來越多的研究證明VAFs 的增殖、遷移與分泌細(xì)胞外基質(zhì)等在血管重構(gòu)過程中起著重要的作用［1］。將VAFs 作為治療靶點，有效地抑制其增殖、遷移對防治血管增殖性疾病有重要意義。干擾素誘導(dǎo)蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)是干擾素(interferon，IFN)誘導(dǎo)蛋白p200 家族的人源蛋白成員之一，具有抑制細(xì)胞增殖與促進細(xì)胞凋亡的作用［2］。有研究［3］發(fā)現(xiàn)，IFI16 蛋白可通過p53/p21 通路抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但IFI16 對VAF 增殖、遷移等生物學(xué)功能的影響尚未見報道。本研究旨在誘導(dǎo)VAFs 上IFI16過表達和沉默其表達，觀察IFI16 對VAFs 增殖與遷移的影響，并探討其可能機制，為將IFI16 運用于治療血管增殖性疾病提供更多的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人腦血管外膜成纖維細(xì)胞(human brain vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)細(xì)胞株購自Scien-Cell;DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone;p53 抗體和p21 抗體購自Epitomics;IFI16 抗體、βactin 抗體、IFI16 siRNA(h)、control siRNA-A、control siRNA(FITC-conjugated)-A、siRNA transfection medium 和siRNA transfection reagent 購自Santa Cruz;IFNα 購自北京三元基因工程有限公司;細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒和SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自碧云天公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas;real-time PCR 熒光染料試劑盒購自TakaRa;Transwell 小室購自Corning;PCR 擴增引物購自上海生工生物工程公司，見表1。

表1 引物序列Table 1. The sequences of primers

2 方法

2.1 HBVAFs 的培養(yǎng) 從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管復(fù)蘇細(xì)胞。取復(fù)蘇后第3 ～4 代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗。

2.2 實驗分組 實驗分為6 組，即空白組、control siRNA 組和IFI16 siRNA 組，用2 ×106U/L IFN-α 分別處理各組24 h 后，即獲IFN-α +空白組、IFN-α +control siRNA 組和IFN-α+ IFI16 siRNA 組。

2.3 Real-time PCR 檢測mRNA 表達 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按Trizol 法提取總RNA，按照RT-PCR 試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄條件:42 ℃60 min，70 ℃5 min。然后再按照熒光PCR 試劑盒說明書進行PCR 擴增。Real-time PCR 采用StepOnePlusTM系統(tǒng)(ABI)，反應(yīng)條件:95 ℃30 s 預(yù)變性，95 ℃5 s，60 ℃34 s，重復(fù)循環(huán)40 次，熔解曲線分析95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。以β-actin 為內(nèi)參照，2－ΔΔCt法計算各組IFI16、p53和p21 mRNA 的相對表達量。

2.4 Western blotting 檢測蛋白表達 按細(xì)胞裂解液(RIPA)說明書提取細(xì)胞蛋白。用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，置沸水煮5 min 變性蛋白質(zhì);電泳(IFI16 使用10%分離膠，p53 和p21 使用12%分離膠)，電壓80 V，進入濃縮膠后改為120 V。濕電轉(zhuǎn)膜，電流200 mA，轉(zhuǎn)膜時間1 h;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;TBST洗膜3 次，每次10 min;Ⅰ抗4 ℃(IFI16 抗體、p53 抗體、p21 抗體和β-actin 抗體稀釋度分別為:1 ∶500、1∶1 000、1∶1 000 和1∶5 000)過夜孵育;TBST 洗膜3次，每次10 min ;37 ℃孵育Ⅱ抗1 h;TBST 洗膜3次，每次10 min;加入ECL 反應(yīng)，印跡。用掃描儀掃描曝光膠片，BandScan 4. 3 軟件進行總灰度分析。以β-actin 為內(nèi)參照，分析各組IFI16、p53 和p21 蛋白的相對含量。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 按細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書操作進行細(xì)胞收集、染色后通過流式細(xì)胞儀進行DNA 含量分析。

2.6 細(xì)胞劃線法觀察細(xì)胞遷移 在12 孔板背后均勻畫出3 條橫穿過孔的線條，待孔內(nèi)空白組、control siRNA 組和IFI16 siRNA 組細(xì)胞匯合度達90%以上后用劃線工具垂直于孔背面橫線劃痕。棄去孔內(nèi)液體，并用PBS 液清洗2 遍。在另外上述3 組各孔內(nèi)加入含2 ×106U/L IFN-α 的5%血清DMEM 培養(yǎng)基1 mL。顯微鏡下拍照后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。24 h 后取樣，拍照。計算遷移距離，遷移距離=劃痕0 h 后劃痕寬度－ 劃痕24 h 后劃痕寬度，以像素(pixel)作為長度單位。

2.7 Transwell 小室定量遷移細(xì)胞 取空白組、control siRNA 組和IFI16 siRNA 組對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化細(xì)胞計數(shù)后，用含0.1 %胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1 ×108/L。每個小室(上室)中加入100 μL 上述細(xì)胞懸液，在24 孔板內(nèi)(下室)加入含10 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基800 μL，在另外的上述3 組上、下室內(nèi)加入IFN-α，使之終濃度分別為2 ×106U/L。將24 孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，上室用PBS 液洗滌3 遍后，將小室置于4%多聚甲醛中固定20 min，后將其置于超凈臺中自然晾干。將小室置于0.1%結(jié)晶紫中染色20 min，再用PBS 液洗滌3 遍。晾干后，顯微鏡下隨機選取4 個視野，觀察細(xì)胞，并計數(shù)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，結(jié)果用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組IFI16、p53 和p21 表達的變化

IFI16 siRNA 組中IFI16、p53 和p21 蛋白及mRNA 水平低于空白組(P ＜0. 05)，空白組與control siRNA 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在IFN-α 處理后，IFN-α+空白組、IFN-α +control siRNA 組和IFN-α +IFI16 siRNA 組中IFI16、p53 和p21 蛋白及mRNA 水平均高于空白組(P ＜0.05)。IFN-α +IFI16 siRNA組中IFI16、p53、p21 蛋白及mRNA 水平低于IFN-α+空白組(P ＜0.05)，IFN-α+空白組與IFN-α +control siRNA 組間IFI16、p53 和p21 差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、表2。

Figure 1. Effects of IFI16 siRNA and IFN-α on the expression of IFI16，p53 and p21 proteins in HBVAFs.圖1 干預(yù)后IFI16、p53 及p21 蛋白在HBVAFs 中的表達情況

表2 干預(yù)后HBVAFs 中IFI16、p53 及p21 mRNA 表達情況Table 2. Effects of IFI16 siRNA and IFN-α on the expression of IFI16，p53 and p21 mRNA in HBVAFs (mean±SD.n=3)

2 各組細(xì)胞周期情況比較

IFI16 siRNA 組G0/G1期細(xì)胞低于空白組(P ＜0.05)，S 期細(xì)胞則高于后者(P ＜0.05)，空白組與control siRNA 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在IFN-α 處理后，IFN-α + 空白組、IFN-α + control siRNA 組和IFN-α+IFI16 siRNA 組中G0/G1期細(xì)胞高于空白組(P ＜0.05)，S 期細(xì)胞則低于后者(P ＜0.05)。IFN-α+ IFI16 siRNA 組中G0/G1期細(xì)胞低于IFN-α +空白組(P ＜0.05)，S 期細(xì)胞則高于后者(P ＜0.05)，IFN-α+空白組與IFN-α+control siRNA 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2、表3。

Figure 2. Effects of IFI16 siRNA and IFN-α on cell cycle of HBVAFs.圖2 IFI16 siRNA 和IFN-α 對HBVAFs 細(xì)胞周期的影響

3 各組細(xì)胞遷移情況比較

IFI16 siRNA 組、空白組與control siRNA 組之間在細(xì)胞遷移數(shù)量與遷移范圍上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在IFN-α 處理后，IFN-α + 空白組、IFN-α + control siRNA 組和IFN-α+IFI16 siRNA 組細(xì)胞遷移數(shù)量與范圍均低于空白組(P ＜0.05)。IFN-α + IFI16 siRNA 組細(xì)胞遷移數(shù)量與范圍高于IFN-α +空白組(P＜0.05)，IFN-α + 空白組與IFN-α + control siRNA組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3、4、表3。

Figure 3. Effect of IFI16 siRNA on migration capability of HBVAFs.圖3 轉(zhuǎn)染IFI16 siRNA 后對HBVAFs 遷移的影響

Figure 4. Effects of IFN-α and IFI16 siRNA on migration capability of HBVAFs.圖4 轉(zhuǎn)染IFI16 siRNA 并加用IFN-α 處理對HBVAFs 遷移的影響

表3 IFI16 siRNA 和IFN-α 對HBVAFs 細(xì)胞周期與遷移的影響Table 3. Effects of IFI16 siRNA and IFN-α on cell cycle and migration of HBVAFs(mean±SD. n=3)

討 論

在血管重構(gòu)過程中，VAFs 被激活，其增殖、分泌細(xì)胞因子及合成細(xì)胞外基質(zhì)能力明顯增加;并表達α-平滑肌肌動蛋白，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，其中部分肌成纖維細(xì)胞遷移至內(nèi)膜分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致了晚期膠原纖維化，從而引起管腔狹窄［1］。由于VAFs在血管重構(gòu)過程中起著至關(guān)重要的作用已經(jīng)被視為血管增殖性疾病防治研究的重點之一。

IFN 是一組具有抗病毒、抗增殖、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)效應(yīng)的活性細(xì)胞因子家族［4-5］。研究［6-7］表明，局部轉(zhuǎn)染IFN-β 基因和腸外給予IFN-γ能抑制動脈球囊損傷后血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管新生內(nèi)膜形成，提示將IFN 應(yīng)用于血管增殖性疾病的治療是可行的。然而IFN 的多種生物學(xué)效應(yīng)與一系列被稱為干擾素誘導(dǎo)蛋白的蛋白有密切關(guān)系［4-5］。

IFI16 屬于IFN 誘導(dǎo)蛋白p200 家族的人源蛋白成員，其編碼基因位于人染色體1q21 ～23［8］。IFI16蛋白在人體多種器官組織如肝、子宮、泌尿生殖道、乳腺導(dǎo)管、皮膚的上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等有表達［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，IFI16 在HBVAFs 也存在基礎(chǔ)表達，并能被IFN-α 誘導(dǎo)表達。前人通過體外實驗［2-3］發(fā)現(xiàn)增加IFI16 的表達能抑制細(xì)胞的增殖與遷移。而且將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IFI16 基因的HNO163 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞與不表達IFI16 的HNO163 細(xì)胞分別注射于出生7 周的裸鼠，發(fā)現(xiàn)HNO163-IFI16 組形成的腫瘤明顯小于對照組，腫瘤內(nèi)新生血管的合成也減少了［2］。本研究也發(fā)現(xiàn)單純下調(diào)IFI16 的表達雖然對HBVAF 遷移無明顯影響但能促進細(xì)胞G1/S 期轉(zhuǎn)換。而當(dāng)IFN-α 誘導(dǎo)IFI16 表達增加后，VAF 的增殖指數(shù)下降，更多的細(xì)胞停滯在G0/G1期，在細(xì)胞周期進程受限的同時細(xì)胞遷移能力也隨之下降;但在成功瞬時轉(zhuǎn)染了IFI16 siRNA 的HBVAFs 中IFN-α 這一作用受到明顯限制，推測IFI16 可能是參與IFN-α 抑制VAF 增殖與遷移的機制之一，也進一步證實IFI16 表達具有抑制VAF 增殖與遷移的作用。

抑癌基因p53，能夠通過下游基因p21 抑制細(xì)胞周期進程，促進細(xì)胞凋亡與老化［4，11］，研究發(fā)現(xiàn)IFI16可通過p53/p21 與Rb/E2F1(同樣具有調(diào)控細(xì)胞周期功能)途徑抑制細(xì)胞增殖，但當(dāng)抑制了p53 及Rb的表達及活性后，IFI16 抑制增殖的作用無法實現(xiàn)［3］。并且在前列腺癌細(xì)胞LNCaP(具有p53 與Rb功能)與PC-3(具有Rb 功能但無p53 功能)中分別過表達IFI16 蛋白后，細(xì)胞增殖抑制率也表現(xiàn)出明顯差異:LNCaP(＞90%)＞PC-3(50%)［8］。亦有實驗證實，在IFI16 蛋白氨基端上200A 結(jié)構(gòu)域中MFHATVATIF 基序與p53 羧基端結(jié)合后，活化后者bax啟動子從而激活p53 表達，增加其下游目的基因p21表達［9］，另一個結(jié)構(gòu)域200B 也能與p53 DNA-binding 的核心區(qū)域結(jié)合，從而起到穩(wěn)定p53-DNA 復(fù)合體的作用［12］。前人的研究表明IFI16 在抑制細(xì)胞增殖過程中與p53 和p21 有密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示IFN-α 在誘導(dǎo)IFI16 表達增加的同時p53 與p21 的表達也上調(diào)了。而在沉默IFI16 基因后不但可下調(diào)HBVAFs 中p53 和p21 基線表達而且也抑制了IFNα 誘導(dǎo)的表達。在VAFs 中IFI16 與p53 和p21 一致的變化趨勢表明IFI16 抑制VAFs 增殖與遷移可能與促進p53 和p21 的表達有關(guān)。

綜上所述，在HBVAFs 中存在IFI16 的表達，后者具有抑制VAFs 增殖和遷移的作用;p53/p21 途徑可能參與該生物學(xué)效應(yīng)的下游調(diào)控。

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