小凹蛋白-1 下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外鈣敏感受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流的作用機制*

鐘 華， 龔 艷， 吳玲玲， 趙 慧， 王 靜， 孫志萍， 鄧峰美， 何 芳△

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院1新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，2病理生理教研室，3醫(yī)學(xué)機能實驗中心，新疆 石河子832002)

血管內(nèi)皮功能障礙是高血壓、冠心病、糖尿病等多種心腦血管疾病的共同病理機制，主要與NO 的作用有關(guān)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)Ca2+內(nèi)流是激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)生成NO 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(intracellular Ca2+concentration，［Ca2+］i)可由各種信號分子、鈣泵及鈣離子通道等多種因素精確調(diào)控，細(xì)胞外鈣敏感受體(extracellular Ca2+-sensing receptor，CaR)是調(diào)節(jié)［Ca2+］i的重要膜受體，而小凹蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)又是與CaR 相互作用的蛋白之一。并且我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中，Cav-1 和CaR 兩者共定位于細(xì)胞膜，精胺(spermine)可通過激活CaR 引起［Ca2+］i增加，此作用可被caveolae 結(jié)構(gòu)破壞劑非律平(filipin)或Cav-1基因沉默進一步加強［1］。這提示我們:如果能夠從Cav-1 和CaR 蛋白相互作用角度進一步闡明CaR 在介導(dǎo)［Ca2+］i增高和NO 生成及調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能中的作用和機制，有助于以介導(dǎo)鈣活動通路的作用靶點，進行藥物篩選并提出聯(lián)合治療策略，有可能從根本上保護和改善內(nèi)皮功能，為心腦血管疾病防治提供一條新途徑。因此，本次研究的目的除了用另一種caveolae 結(jié)構(gòu)破壞劑甲基-β-環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin，MβCD)驗證此結(jié)論外，主要從Cav-1 和CaR相互作用及兩者在caveolae 區(qū)轉(zhuǎn)位進一步探討Cav-1對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CaR 介導(dǎo)鈣內(nèi)流的作用機制。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

1.1 臍帶來源 健康孕婦剖宮產(chǎn)的新鮮臍帶(來自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院，經(jīng)倫理道德委員會批準(zhǔn)和個人知情同意)。

1.2 主要試劑 胰酶、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、spermine、filipin 和Calhex 231 均購自Sigma;Cav-1Ⅰ抗和flotillin-1Ⅰ抗均購自Cell Signaling Technology;CaRⅠ抗(Affinity BioReagents，ABR)、外被體蛋白(β-coat protein，β-COP)Ⅰ抗、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)Ⅰ抗、β-actinⅠ抗 均購自Santa;異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的羊抗小鼠及四乙基羅丹明異硫氰酸鹽(tetraethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC)標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(Immunology Consultants Laboratory)，ECL 發(fā)光試劑盒(Thermo)，F(xiàn)ura-2/AM (Molecular Probes)，pGCsi-U6/Neo/DsRed 質(zhì)粒(上海吉凱)，G418 (Biosharp)，去內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega)。

2 方法

2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 依據(jù)本研究室以前的研究方法培養(yǎng)HUVECs，并對其進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)及對細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色來鑒定是否為HUVECs，取2 ～3 代細(xì)胞用于實驗。

2.2 ［Ca2+］i的檢測 第2 ～3 代HUVECs 接種于放有圓形玻片的6 孔板中，按照以下方式分組處理，并持續(xù)灌流20 min，用含2 mmol/L Ca2+的HBS 溶液將藥物配制成不同濃度:(1)spermine(2 mmol/L)+Ca2+組;(2)MβCD(2 mmol/L)+ spermine +Ca2+組;(3)calhex231(1 μmol/L)+ spermine +MβCD +Ca2+組。當(dāng)接種于圓形玻片上的HUVECs 達80%融合時，用含F(xiàn)ura-2/AM 的含鈣液孵育細(xì)胞，去酯化。將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡上，用自行研制的全自動顯微灌流控制系統(tǒng)控制所加藥物灌流液的轉(zhuǎn)換，并用340 nm 與380 nm 波長的激發(fā)光激發(fā)Ca2+熒光探針Fura-2 發(fā)射熒光，用CCD 拍攝熒光的動態(tài)變化并通過鈣熒光成像系統(tǒng)IPA software 進行分析，通過340 nm 和380 nm 的熒光強度比值的變化(即Δratio)反映［Ca2+］i，以上每組實驗重復(fù)5 次。

2.3 Western blotting 檢測HUVECs Cav-1 和CaR 蛋白表達 用同一代的HUVECs 分為4 組:即對照組(control)、不同濃度加藥組(1 mmol/L 、2 mmol/L、5 mmol/L MβCD)，HUVECs 經(jīng)不同濃度MβCD 處理6 h 后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 沖洗后，加入裂解液，提取細(xì)胞總蛋白和膜蛋白，BCA 試劑測定蛋白含量，電泳，半干轉(zhuǎn)，然后封閉，分別加入抗Cav-1(1∶1 000)和CaR (1∶500)的Ⅰ抗，孵育過夜。次日用TBST 洗膜3 次各20 min，加入相應(yīng)的Ⅱ抗(1∶1 000)，搖床上孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次各20 min;ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，顯影定影處理，獲得實驗結(jié)果，用Smart Viewer 軟件進行灰度分析，β-actin蛋白條帶為內(nèi)參照，以上各組實驗重復(fù)3 次。

2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染 本實驗質(zhì)粒為上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建pGCsi-U6/Neo/DsRed 重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)測序證實了克隆的RNAi 打靶序列100%正確。熱激法轉(zhuǎn)化:制備選擇性培養(yǎng)基平板;取出1 管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化;按每0.1 mL 感受態(tài)細(xì)胞加入約2 ng 質(zhì)粒DNA，輕柔混勻，在冰上放置30 min;將離心管放置42 ℃水浴，熱擊45 s 后快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，靜置2 min;每管加400 mL SOC 培養(yǎng)基，在37 ℃搖床溫和搖動溫育1 h，使細(xì)菌復(fù)蘇;取適當(dāng)體積均勻涂布于含有抗生素(Amp)的LB 瓊脂平板;倒置培養(yǎng)皿，于37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選單克隆菌落再次搖菌，次日用質(zhì)粒提取試劑盒提取并檢測質(zhì)粒DNA 濃度，－80 ℃保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)染:實驗分為:未轉(zhuǎn)染組即空白對照組(control 組)、空質(zhì)粒組(vehicle 組)和特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組即實驗組(Cav-1 shRNA 組)，待細(xì)胞生長至70% ～90%融合度時，按照LipofectamineTM2000 (Invitrogen)說明書操作步驟進行轉(zhuǎn)染。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將該復(fù)合物與HUVECs 混合，4 h 后換正常培養(yǎng)基。瞬時轉(zhuǎn)染48 h 后，熒光顯微鏡下觀察RFP，加入G418 (200 mg/L)進行篩選，待未表達抗性基因的細(xì)胞被殺死后，將G418 改為100 mg/L 維持1 周。以上轉(zhuǎn)染實驗重復(fù)3 次，各組分別提取HUVECs 總蛋白和膜蛋白，Western blotting 檢測HUVECs Cav-1 和CaR 蛋白表達及Cav-1 基因干擾效率。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和干擾效率檢測在前期研究中已完成，本實驗直接使用該質(zhì)粒進行下一步［2］。

2.5 免疫共沉淀檢測不同組HUVECs Cav-1 與CaR蛋白相互作用 將細(xì)胞分成靜息狀態(tài)組、spermine +Ca2+組(用含2 mmol/L Ca2+的HBS 溶液將精胺配制成2 mmol/L，處理細(xì)胞3 min)、filipin+Spermine+Ca2+組(用1.5 mg/L filipin 預(yù)處理30 min 后加2 mmol/L spermine+Ca2+處理細(xì)胞3 min)和MβCD+Spermine+Ca2+組(用2 mmol/L MβCD 預(yù)處理30 min 后加2 mmol/L spermine+Ca2+處理細(xì)胞3 min)，Cav-1 基因干擾后，用細(xì)胞刮刀法收集處理后的細(xì)胞，用適用于Co-IP 的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 ×g離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至新管中，分別加入protein A agrose 10 μL 預(yù)清洗后，BCA 方法定量，加入Ⅰ抗，在4 ℃條件下垂直混勻過夜，次日加protein A beads，4 ℃混勻2 h，500 ×g 離心2 min，棄上清，珠子用裂解緩沖液洗滌5 次后，用20 μL 的加樣緩沖液重懸，100 ℃加熱10 min。

2.6 蔗糖密度梯度離心法提取并鑒定caveolae，檢測不同處理因素對Cav-1 和CaR 蛋白在caveolae 共定位及轉(zhuǎn)位的影響 Na2CO3蔗糖密度梯度離心法［3］:所有步驟均在4 ℃下進行。各組細(xì)胞經(jīng)處理后用2 mL 含1% cocktail 的500 mmol/L Na2CO3(pH 11.0)溶液冰上孵育30 min。細(xì)胞刮刀法收集裂解液，勻漿器勻漿和超聲破碎細(xì)胞后，將含細(xì)胞裂解物的離心管底部加入由MBS［25 mmol/L 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (pH 6.5)，0.15 mol/L NaCl］配制成的2 mL 90%蔗糖，離心管頂部依次加入4 mL 35%、4 mL 5%蔗糖(用含250 mmol/L Na2CO3MBS配制)，4 ℃、38 000 r/min，離心18 h。自上而下依次吸出離心條帶，每次1 mL，共可獲得12 個樣本，各樣本經(jīng)SDS-PAGE 電泳，Western blotting 檢測caveolae的標(biāo)志蛋白(Cav-1 和flotillin-1)及CaR 表達。此外，在提取caveolae 的膜碎片過程中可能混雜有胞漿、高爾基體及細(xì)胞膜成分，在這些部位也可檢測到Cav-1表達，為排除上述成分存在，進一步保證結(jié)果可靠性，在提取膜碎片caveolae 過程中，對提取的膜碎片除了檢測標(biāo)志蛋白外，還同時檢測胞膜、胞漿和高爾基體標(biāo)志蛋白:TfR、β-actin 和β-COP。為進一步對Cav-1 和CaR 表達進行定量和轉(zhuǎn)位分析，收集200 μL 富含Cav-1 膜(Cav-1-enriched membrane，CEM)區(qū)、非caveolae I 區(qū)(noncaveolar fraction I，NCF I)和II 區(qū)(NCF II)樣本，Western blotting 分別檢測Cav-1和CaR 表達。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ±SEM)表示，組間比較用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件包進行分析，以P ＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HUVECs 的培養(yǎng)與鑒定

原代細(xì)胞放入培養(yǎng)箱12 h，在倒置顯微鏡下觀察融合的HUVECs 呈典型的鋪路石或鵝卵石樣排列;對細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，95%以上的細(xì)胞呈陽性著色，證實細(xì)胞為HUVECs［3］。

2 不同處理因素刺激下HUVECs［Ca2+］i 的變化

細(xì)胞外液為2 mmol/L 含鈣液時，與spermine +Ca2+組相比，MβCD + spermine + Ca2+組［Ca2+］i明顯升高(P ＜0.05)，顯示spermine 升高［Ca2+］i的作用可被MβCD 進一步加強。與spermine +Ca2+組和MβCD + spermine + Ca2+組相比，Calhex 231 +MβCD+ spermine + Ca2+組［Ca2+］i明顯降低(P ＜0.05)，見圖1，顯示CaR 的負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex 231 可完全阻斷spermine 刺激引起的［Ca2+］i升高。

3 Western blotting 檢測HUVECs 不同濃度MβCD對Cav-1 和CaR 蛋白表達的影響

MβCD 處理后，control 組、1 mmol/L MβCD 組、2 mmol/L MβCD 組和5 mmol/L MβCD 組中Cav-1 的蛋白含量相對值分別為1.61 ±0.06、1.64 ±0.04、1.67 ±0.09 和1.61 ±0.07，CaR 的蛋白含量相對值分別為0.74 ± 0.46、0.75 ± 0.10、0.78 ± 0.11 和0.75 ±0.08;各加藥組與相應(yīng)control 組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖2。這說明小凹的結(jié)構(gòu)破壞后并不影響Cav-1 和CaR 蛋白的表達。

4 不同處理因素刺激下HUVECs 內(nèi)CaR 和Cav-1的相互作用

4.1 收集正常未經(jīng)處理的HUVECs，正向Co-IP 用CaR 抗體作為Ⅰ抗，反向Co-IP 用Cav-1 抗體作為Ⅰ抗，檢測到Cav-1 和CaR 有相互作用，見圖3A。

4.2 Spermine + Ca2+組、filipin + spermine + Ca2+組、MβCD+spermine + Ca2+組正向或反向Co-IP 的Cav-1/CaR 分別與靜息狀態(tài)下的正向或反向Co-IP的Cav-1/CaR 相對比值的百分?jǐn)?shù)表示Cav-1 和CaR相互作用強弱，見圖3B，各組間差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，提示不同處理因素對Cav-1 和CaR 蛋白的相互作用沒有影響。

4.3 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對Cav-1 和CaR 蛋白表達及相互作用的影響 與control 組干擾效率(0%)相比，Cav-1 shRNA 組Cav-1 蛋白表達降低(抑制率為70%，P ＜0.05)，與vehicle 組干擾效率比較無顯著差異(P ＞0.05)。各組間CaR 總蛋白表達無顯著差異(P ＞0.05)。該質(zhì)粒干擾效率在前期研究中已完成。

干擾處理后細(xì)胞中CaR 表達隨Cav-1 表達量降低而降低，但Cav-1 shRNA 處理組與control 組蛋白間的相互作用差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，提示對Cav-1 RNA 干擾對Cav-1 和CaR 蛋白的相互作用沒有影響，見圖3C。

Figure 1. Changes of ［Ca2+］i in HUVECs with different treatments. A:representative tracing from Fura-2-loaded HUVECs exposed to 2 mmol/L spermine for 20 min in buffer with 2 mmmol/L Ca2+，spermine stimulated an increase in［Ca2+］i;B:the［Ca2+］i increase induced by spermine was further increased after acute caveolae disruption with 2 mmol/L MβCD;C:the effect of MβCD on the［Ca2+］i increase was abolished after inhibition of CaR by its negative allosteric modulator Calhex 231 (1 μmol/L);D:comparison of the effects of different treatments on［Ca2+］i in HUVECs. Mean ±SEM. n=5. * P ＜0.05 vs spermine +Ca2+ group;#P＜0.05 vs MβCD+spermine+Ca2+ group.圖1 不同處理因素刺激下HUVECs［Ca2+］i 的變化

Figure 2. The effect of MβCD on the protein expression of CaR and Cav-1 in HUVECs.Mean±SEM.n=3.圖2 MβCD 對Cav-1 和CaR 蛋白表達的影響

5 蔗糖密度梯度離心法提取并鑒定caveolae，觀察不同處理因素對Cav-1 和CaR 蛋白在caveolae 共定位及轉(zhuǎn)位的影響

細(xì)胞裂解物經(jīng)蔗糖密度梯度離心后可獲得12個樣本，各樣本采用Western blotting 技術(shù)檢測到第4和第5 樣本含大量caveolae 的標(biāo)志蛋白Cav-1 和flotillin-1，同時也檢測到該區(qū)域無胞漿成分β-actin、高爾基體成分β-COP 和胞膜 標(biāo)志蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR 的表達(圖4)，說明含caveolae 膜碎片提取是成功的，可確定所提第4 和第5 樣本為CEM 區(qū)。同時在該區(qū)域可發(fā)現(xiàn)有大量CaR 蛋白表達，說明Cav-1和CaR 共定位于同一caveolae 區(qū)。收集200 μL 含Cav-1 的樣本4 和5 膜碎片并混勻，分別收集各100 μL 不含Cav-1 的樣本6 ～8 及9 ～12 膜碎片并混勻，將此區(qū)分別定義為NCF I 和II 區(qū)，經(jīng)不同因素處理后對CEM、NCF I 和NCF II 區(qū)的Cav-1 蛋白定量分析結(jié)果顯示:與control 組比較，spermine + Ca2+組、filipin + spermine + Ca2+組和MβCD + spermine +Ca2+組CEM 區(qū)的 Cav-1 蛋白表達分別降低了3.46%、1.07%和1.18% (均P ＜0.05)，NCF I 區(qū)的Cav-1 蛋白表達分別增加了1.61%、1.53% 和1.55% (均P ＜0.05)，NCF II 區(qū) 的Cav-1 蛋白表達分別增加了6.64%、9.43%和2.55% (均P ＜0.05);CaR 蛋白定量分析結(jié)果亦顯示:與control 組比較，spermine + Ca2+組、filipin + spermine + Ca2+組 和MβCD+spermine+ Ca2+組CEM 區(qū)的CaR 蛋白表達分別降低了1.56%、1.40%和1.38% (均P ＜0.05)，NCF I 區(qū) 的CaR 蛋白表達分別增加了78.53%、76.51%和68.99% (均P ＜0.05)，NCF II 區(qū)的CaR蛋白表達的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P ＞0.05)，見圖5。

Figure 3. Interaction of Cav-1 and CaR in HUVECs with different treatments. The lysates of HUVECs were immunoprecipitated (IP)with antibody (Ab)of CaR or Cav-1 initially，and was immunoblotted (IB)using the indicated respective or control IgG antibody. Non-precipitated lysates (input)were loaded as control. A:the interaction of Cav-1 and CaR proteins in quiescent condition;B:the interaction of Cav-1 and CaR proteins in different experiment groups;C:the interaction of Cav-1 and CaR proteins after Cav-1 shRNA transfection in HUVECs.圖3 不同處理因素刺激下HUVECs CaR 和Cav-1 的相互作用

Figure 4. Expression of CaR and Cav-1 proteins in the fractions isolated by sucrose density gradient centrifugation from HUVECs with different treatments. After exposed to different treatments for 30 min，HUVECs were homogenized and fractionated using detergent-free (Na2CO3)sucrose density gradient centrifugation. From top of the gradient，12 fractions were collected. Aliquots of each fraction (200 μL)were precipitated and investigated by Western blotting with Cav-1，CaR，flotillin-1，β-coat protein (β-COP)，β-actin and transferrin receptor (TfR)antibodies. A:control;B:spermine+Ca2+;C:filipin+spermine+Ca2+;D:MβCD+spermine+Ca2+.圖4 不同處理因素刺激下HUVECs 經(jīng)蔗糖密度梯度離心法分離的碎片中CaR 和Cav-1 蛋白的表達

Figure 5. Expression of CaR and Cav-1 proteins in Cav-1-enriched membrane (CEM)fractions，noncaveolar fraction I (NCF I)and noncaveolar fraction II (NCF II)of HUVECs with different treatments. Equal amounts of the control and experimental samples of Cav-1-enriched membrane fractions 4 and 5 (CEM)，noncaveolar fractions 6 ～8 (NCF I)and noncaveolar fractions 9 ～12 (NCF II)were pooled，precipitated and assayed by Western blotting with Cav-1，CaR，β-COP and β-actin antibodies. Mean±SEM. n=3. * P ＜0.05 vs control.圖5 不同處理因素刺激下HUVECs GEM、NCF I 和NCF II 區(qū)中CaR 和Cav-1 蛋白的表達

討 論

Ca2+是一種細(xì)胞內(nèi)普遍存在的第二信使，在細(xì)胞內(nèi)傳遞信息，并調(diào)控一系列生命過程［4］。它在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外執(zhí)行其功能必須首先達到或維持一定濃度，在細(xì)胞內(nèi)外維持一定的濃度差。［Ca2+］i的升高主要通過胞內(nèi)Ca2+釋放和胞外Ca2+內(nèi)流兩大途徑。在內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流主要由CaR 介導(dǎo)的鈣通道參與，均定位于caveolae 且受Cav-1 調(diào)節(jié)［5-6］，在不同細(xì)胞及不同激動劑引發(fā)的鈣活動中，Cav-1 的調(diào)節(jié)作用不盡相同［6-7］，因此在HUVECs 中，兩者相互作用，在功能上的具體表現(xiàn)是值得深入研究的。

而本實驗中在前期的研究基礎(chǔ)上，在細(xì)胞有外鈣來源的情況下(灌流液中含Ca2+)，用另一種caveolae 結(jié)構(gòu)抑制劑MβCD 處理細(xì)胞后再用精胺刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精胺激活CaR 升高［Ca2+］i作用可被進一步加強。為了進一步證實上述過程與CaR 激活有關(guān)，用Calhex 231 阻斷CaR 后用精胺刺激HUVECs，再用MβCD 破壞caveolae 結(jié)構(gòu)，此時，MβCD 的上述效應(yīng)被完全阻斷，與filipin 作用一致。這都說明Calhex 231 阻斷CaR 引發(fā)的鈣池耗竭(內(nèi)鈣釋放)同時，外鈣內(nèi)流也被完全阻斷，此外鈣內(nèi)流依賴鈣池耗竭，與CaR 激活有關(guān)，即在HUVECs 中，Cav-1 對CaR 介導(dǎo)的鈣內(nèi)流有下調(diào)作用。

在本研究中進一步用免疫共沉淀的方法檢測兩者在HUVECs 中的相互作用。正常未處理的HUVECs 免疫共沉淀反應(yīng)，正向和反向?qū)嶒灦寄軝z測到CaR 和Cav-1 的表達，表明在靜息狀態(tài)下CaR 和Cav-1 在HUVECs 中存在相互作用。實驗中又用CaR 的激動劑精胺刺激細(xì)胞，正向和反向免疫共沉淀反應(yīng)結(jié)果顯示，CaR 和Cav-1 的相互作用在激動劑刺激下并沒有明顯變化，表明在CaR 激活發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的過程中，CaR 和Cav-1 可能是相互結(jié)合而發(fā)揮作用的。用filipin 或MβCD 破壞caveolae 結(jié)構(gòu)再用精胺刺激細(xì)胞，或用RNAi 技術(shù)沉默Cav-1 基因，在保證Cav-1 基因干擾效率前提下，正向和反向免疫共沉淀反應(yīng)結(jié)果顯示也未影響CaR 和Cav-1 的相互作用。結(jié)合上述CaR 和Cav-1 在HUVEC 的caveolae共定位研究結(jié)果，我們認(rèn)為caveolae 結(jié)構(gòu)破壞或Cav-1 基因干擾雖然可抑制兩者在同一caveolae 區(qū)的共定位，但并不影響CaR 和Cav-1 的相互作用。為了進一步探討Cav-1 和CaR 蛋白在caveolae 共定位及轉(zhuǎn)位。采用蔗糖密度梯度離心［8］的方法處理HUVECs 后的檢測結(jié)果表明，CaR 激動劑精胺或caveolae 結(jié)構(gòu)破壞劑filipin 和MβCD(能破壞小凹的主要脂質(zhì)成分膽固醇和磷脂，影響Cav-1 功能，但對細(xì)胞膜的完整性無影響［7］)處理HUVECs 后均可引起Cav-1 和CaR 的轉(zhuǎn)位，其中Cav-1 主要從CEM 區(qū)轉(zhuǎn)位至NCF II 區(qū)，而CaR 則從CEM 區(qū)轉(zhuǎn)位至NCF I區(qū)。

因此本研究首次證實，HUVECs 中Cav-1 和CaR共定位于同一caveolae 區(qū)，同時Cav-1 對CaR 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流有下調(diào)作用機制可能與Cav-1 抑制CaR 膜定位、促使其向非caveolae 區(qū)轉(zhuǎn)位及減弱其對激動劑反應(yīng)性有關(guān)。該研究結(jié)果也進一步體現(xiàn)了Cav-1 對CaR 生物學(xué)效應(yīng)調(diào)節(jié)的復(fù)雜性［9］，為今后進一步從調(diào)節(jié)［Ca2+］i相關(guān)蛋白角度探討心血管疾病的發(fā)病機制和防治措施提供了一個新的途徑。

［1］ Wang ZH，Hu QH，He F，et al. Extracellular Ca2+-sensing receptor-induced extracellular Ca2+influx is down-regulated by caveolin-1 in human umbilical vein endothelial cells［J］. Acta Physiol Sin，2011，63(1):39-47.

［2］ 王振煥，胡清華，鐘 華，等.小凹蛋白-1 在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CaR 介導(dǎo)NO 生成中的作用和機制［J］.中國病理生理雜志，2011，27(5):934-938.

［3］ 王振煥，陳雄英，胡清華，等.小凹蛋白-1 和鈣受體在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達［J］.石河子大學(xué)學(xué)報，2010，28(2):194-197.

［4］ Zhang W，Xu C. Calcium sensing receptor and heart diseases［J］.Pathophysiology，2009，16(4):317-323.

［5］ Murata T，Lin MI，Stan RV，et al. Genetic evidence supporting caveolae microdomain regulation of calcium entry in endothelial cells［J］. J Biol Chem，2007，282 (22):16631-16643.

［6］ Xu Y，Buikema H，van Gilst WH，et al. Caveolae and endothelial dysfunction:Filling the caves in cardiovascular disease［J］. Eur J Pharmacol，2008，585(2-3):256-260.

［7］ Galan C，Woodard GE，Dionisio N，et al.Lipid rafts modulate the activation but not the maintenance of store-operated Ca2+entry［J］. Biochim Biophys Acta，2010，1803(9):1083-1093.

［8］ Jin S，Zhang Y，Yi F，et al. Critical role of lipid raft redox signaling platforms in endostatin-induced coronary endothelial dysfunction［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(3):485-490.

［9］ Huang CF，Miller RT. The calcium-sensing receptor and its interacting proteins［J］. J Cell Mol Med，2007，11(5):923-934.