血管緊張素Ⅱ1 型受體自身抗體在原發(fā)性腎小球疾病患者血清中的表達(dá)及意義*

熊 京， 楊慧敏， 朱 峰， 梁 瑩， 劉建社， 張 春， 汪 洋

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院1腎內(nèi)科，3心血管內(nèi)科，4急診科，湖北 武漢430022;2湖北省中醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢430061)

原發(fā)性腎小球疾病是中國人群中發(fā)病率占首位的腎臟疾病。雖其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且未完全闡明，但免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是公認(rèn)不爭(zhēng)的研究方向。實(shí)驗(yàn)及臨床研究均證實(shí)始發(fā)的免疫反應(yīng)需引起炎癥反應(yīng)，且炎癥反應(yīng)持續(xù)存在和不斷放大，才能導(dǎo)致腎小球損傷及其臨床癥狀［1-2］。近年來先兆子癇的研究發(fā)現(xiàn)，子宮-胎盤血流灌注減少，缺血缺氧導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，而內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂可觸發(fā)血管緊張素II 1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱtype 1 receptor agonistic autoantibodies，AT1-AA)的產(chǎn) 生［3-4］。AT1-AA作用于AT1受體，上調(diào)各種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，又進(jìn)一步加重缺血缺氧、血管內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致更多的AT1-AA 生成，形成惡性循環(huán)，不斷地放大炎癥反應(yīng)，加重炎性損傷［5-6］。至今為止，AT1-AA 已被報(bào)道參與了血管炎、先兆子癇、惡性高血壓和移植腎排斥反應(yīng)等多種疾病的發(fā)病機(jī)制［3，7］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)在腎小球疾病的發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要的作用［8］，但AT1-AA 在腎小球疾病中的作用卻鮮為人知。因此我們對(duì)300 多例原發(fā)性腎小球患者進(jìn)行了調(diào)查，探討AT1-AA 是否參與了腎小球疾病的發(fā)病機(jī)制，以及它與腎小球疾病的各臨床和病理分型之間的相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

2009 年4 月～2010 年1 月期間于武漢協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科住院的原發(fā)性腎小球疾病患者326 例。入選標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)臨床病史、家族史、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)合腎活檢病理學(xué)檢查，排除腎囊腫、泌尿系結(jié)石及繼發(fā)性腎小球疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、高血壓、過敏性紫癜、乙型肝炎、惡性腫瘤、風(fēng)濕性疾病等)，確診為原發(fā)性腎小球疾病，診斷明確。所有患者12 周內(nèi)均未使用過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)或血管緊張素受體II阻滯劑(angiotensin Ⅱreceptor blocker，ARB)類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):惡性高血壓，定義為舒張壓(diastolic blood pressune，DBP)≥130 mmHg。

患者組的分組標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)根據(jù)在過去的12周內(nèi)是否曾口服和(或)靜脈注射過糖皮質(zhì)激素類藥物、環(huán)磷酰胺、雷公藤、環(huán)孢霉素A、他克莫司、來氟米特、嗎替麥考酚酯、甲氨蝶呤等，分成有免疫抑制劑用藥史組(用藥組)和無免疫抑制劑用藥史組(未用藥組)。(2)根據(jù)有無高血壓分為高血壓組和非高血壓組。高血壓判定方式采用2000 年WHO/ISH 診斷標(biāo)準(zhǔn):收縮壓(systolic blood pressure，SBP)≥140 mmHg 和(或)DBP≥90 mmHg 認(rèn)定為患有高血壓;患者既往有高血壓史，目前正服用抗高血壓藥物，即使血壓已低于140/90 mmHg，仍列入高血壓組。(3)根據(jù)AT1受體自身抗體的檢測(cè)結(jié)果分為AT1-AA(+)組和AT1-AA(-)組。正常對(duì)照組197 例，來自本院體檢中心健康體檢者，胸部正側(cè)位片、心電圖、肝腎功能電解質(zhì)、血糖血脂、心肌酶及血常規(guī)、尿常規(guī)等檢查均未見異常。

2 臨床和病理資料采集

詳細(xì)詢問病史:年齡、性別和既往史。測(cè)量血壓。檢測(cè)血、尿標(biāo)本各項(xiàng)指標(biāo)，包括:血清白蛋白(albumin，ALB)、血清球蛋白、血尿素氮、血清肌酐、血糖、血清膽固醇、血清甘油三酯、24 h 尿蛋白定量、血抗心磷脂抗體、尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N -acetyl-β-glucosaminidase，NAG)、尿視黃醇結(jié)合蛋白(retinol-binding protein，RBP)、尿ALB、尿免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和尿補(bǔ)體3(complement 3，C3)等。B 超引導(dǎo)下行經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)，腎組織常規(guī)行蘇木精- 伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、過碘酸- 希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色、過碘酸-六胺銀染色(periodic acid-silver metheramine，PASM)和Masson 三色染色，光鏡、免疫熒光及電鏡檢查。

3 ELISA 法檢測(cè)血清AT1-AA

AT1受體多肽合成:采用多肽自動(dòng)合成儀(SHIMADZU PSSM-8)，用固相多肽合成法合成具有抗原決定簇的AT1受體細(xì)胞外第2 環(huán)多肽片段。多肽片段序列參照文獻(xiàn)［7］。高壓液相色譜分析合成肽的純度，純度在95%以上。ELISA 法檢測(cè)自身抗體:參照本院心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室建立的方法［7］，檢測(cè)AT1-AA。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，正態(tài)分布的兩組樣本均數(shù)比較，方差齊者采用t 檢驗(yàn)，不齊者采用t’檢驗(yàn);非正態(tài)分布的兩組樣本均數(shù)比較用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，兩樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AT1-AA 在原發(fā)性腎小球疾病患者血清中的表達(dá)

原發(fā)性腎小球疾病患者組的AT1-AA 陽性率明顯高于正常對(duì)照組(P ＜0.01)，見表1。

表1 AT1-AA 在原發(fā)性腎小球疾病患者中的表達(dá)Table 1. Expression of AT1-AA in the patients with primary glomerulopathy

2 免疫抑制劑對(duì)AT1-AA 檢測(cè)結(jié)果的影響

考慮到免疫抑制劑能抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)過程，干擾體內(nèi)抗體的生成，從而可能造成AT1-AA 檢測(cè)結(jié)果的假陰性，故將326 例原發(fā)性腎小球疾病患者分成用藥組和未用藥組后，比較兩組的AT1-AA 陽性率。如表2 所示，用藥組的AT1-AA 陽性率明顯低于未用藥組(P ＜0.05)，證實(shí)了免疫抑制劑的確會(huì)干擾AT1-AA 的檢測(cè)結(jié)果，故后面的分析研究?jī)H在未用藥組患者中進(jìn)行。

表2 免疫抑制劑對(duì)AT1-AA 檢測(cè)結(jié)果的影響Table 2. Effect of immunosuppressive agents (ISA)on AT1-AA detection

3 AT1-AA 在未使用免疫抑制劑的原發(fā)性腎小球疾病患者血清中的表達(dá)

未用藥患者組共計(jì)280 例，其中141 例為女性，139 例為男性，女性患者所占比例為50.36%;平均年齡(36.47 ±14.21)歲;非高血壓組143 例，高血壓組137 例。正常對(duì)照組共計(jì)197 例，其中60 例為女性，137 例為男性，女性患者所占比例為30.46%;平均年齡(47.79 ±12.43)歲;均無高血壓。未用藥患者組的AT1-AA 陽性率達(dá)38.21%，而正常對(duì)照組僅為9.64%，兩者有顯著差異(P ＜0.01)，見表3。

表3 AT1-AA 在未使用免疫抑制劑的原發(fā)性腎小球疾病患者中的表達(dá)Table 3. Expression of AT1-AA in primary glomerulopathy patients without immunosuppressive agents (ISA)

4 原發(fā)性腎小球疾病患者AT1-AA 的表達(dá)與高血壓發(fā)病率的關(guān)系

非高血壓組和高血壓組的AT1-AA 陽性率均顯著高于正常對(duì)照組(P ＜0.01);但非高血壓組和高血壓組之間AT1-AA 陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，提示在腎小球疾病患者中，AT1-AA 與高血壓的發(fā)生可能無明顯的相關(guān)性，見表4。

表4 高血壓對(duì)原發(fā)性腎小球疾病患者AT1-AA 陽性率的影響Table 4. Effect of hypertension (HT)on the positive rate of AT1-AA in the patients with primary glomerulopathy

5 AT1-AA 與原發(fā)性腎小球疾病各臨床/病理類型之間的關(guān)系

按照臨床診斷，我們將280 例未使用免疫抑制劑的原發(fā)性腎小球疾病患者分成4 組:急性腎小球腎炎(acute glomerulonephritis，AGN)組、隱匿型腎小球腎炎(latent glomerulonephritis，LGN)組、慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis，CGN)組和腎病綜合癥(nephrotic syndrome，NS)組。比較各組之間的AT1-AA 陽性率，結(jié)果AGN 陽性率(25%)較其它組稍低，但各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表5。

表5 不同臨床類型的腎小球疾病患者AT1-AA 陽性率的比較Table 5. Comparison of the positive rate of AT1-AA in the glomerulopathy patients with different clinical patterns

280 例未用藥組患者中進(jìn)行了腎活檢病理學(xué)檢查者共196 例，包括膜增生性腎小球腎炎(membrano-proliferative glomerulonephritis，MPGN)患者2 例、膜性腎病(membranous nephropathy，MN)患者12例、局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)患者12 例、IgA 腎病(IgA nephropathy，IgAN)患者63 例和系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)患者107 例。5 種病理類型之間AT1-AA 陽性率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表6。

表6 不同病理類型的腎小球疾病患者AT1-AA 陽性率的比較Table 6. Comparison of the positive rate of AT1-AA in the glomerulopathy patients with different pathological patterns

6 AT1-AA 與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系

AT1-AA(+)組的患者年齡大于AT1-AA(-)組(P ＜0.05);AT1-AA(+)組女性患者所占比例高于AT1-AA(-)組(P ＜0.01);AT1-AA(+)組的血清球蛋白水平高于AT1-AA(-)組(P ＜0.01);其余各項(xiàng)臨床參數(shù)之間在兩組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表7。

表7 AT1-AA 與各臨床參數(shù)的單因素分析Table 7. The univariate analysis of AT1-AA and different clinical parameters

將年齡、性別、SBP、DBP 及血清球蛋白進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析發(fā)現(xiàn):性別和血清球蛋白與AT1-AA的相關(guān)度分別為1.946(95%CI 1.160 ～3.264)和1.087(95%CI 1.025 ～1.152)。年齡、SBP 和DBP 與AT1-AA 的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表8。

表8 AT1-AA 與各臨床參數(shù)的多因素logistic 回歸Table 8. The multivariate logistic regression analysis of AT1-AA and different clinical parameters

討 論

1999 年Wallukat 等［3］在先兆子癇患者血清中檢測(cè)到AT1-AA，隨后在惡性高血壓、移植腎排斥反應(yīng)等患者血清中也相繼發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的AT1-AA。AT1-AA 被認(rèn)為是AT1受體的激動(dòng)劑，與多器官的血管損傷有關(guān)系。本研究通過對(duì)300 多例原發(fā)性腎小球疾病患者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，患者血清中AT1-AA 的陽性率顯著高于正常人群(P ＜0.01)，提示AT1-AA 可能參與了原發(fā)性腎小球疾病的發(fā)病機(jī)制。另外，進(jìn)一步分組發(fā)現(xiàn)，無論非高血壓組或高血壓組原發(fā)性腎小球疾病患者的AT1-AA 陽性率均明顯高于正常對(duì)照組(P ＜0. 01)，但非高血壓組和高血壓組患者之間AT1-AA 陽性率的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，提示AT1-AA 的致腎小球疾病機(jī)制可能獨(dú)立于致高血壓因素之外。

目前已證實(shí)，AT1-AA 與ATl 受體結(jié)合后可通過以下幾個(gè)途徑激活炎癥反應(yīng):(1)影響細(xì)胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，上調(diào)參與炎癥反應(yīng)和凝血過程的靶基因的表達(dá)，促使多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的合成和分泌［7］;(2)生成的多種炎癥介質(zhì)如組織因子、纖溶酶原激活物抑制物1、活性氧等，進(jìn)一步加重缺血缺氧、血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致更多的AT1-AA 生成，形成惡性循環(huán)，不斷放大炎癥反應(yīng)，加重炎性損傷［9-10］;(3)AT1-AA 與ATl 受體結(jié)合后，促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞遞呈抗原、趨化因子的產(chǎn)生以及Th1 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，放大局部炎癥反應(yīng)［11-12］;(4)AT1-AA 具有不隨時(shí)間而失敏感的受體激動(dòng)劑樣活性，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)存在和不斷放大。眾所周知，腎小球內(nèi)持續(xù)存在和不斷放大的炎癥反應(yīng)是原發(fā)性腎小球疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此我們推測(cè):高表達(dá)的AT1-AA 誘發(fā)的持續(xù)炎癥反應(yīng)可能是原發(fā)性腎小球疾病的重要發(fā)病機(jī)制。另外，本研究顯示近期使用過免疫抑制劑的患者AT1-AA 陽性率明顯低于無用藥史的患者，提示免疫抑制劑能有效地抑制AT1-AA 的生成，減少AT1-AA 的致病作用，從而延緩病情的進(jìn)展。

我們進(jìn)一步分析了AT1-AA 與原發(fā)性腎小球疾病患者臨床參數(shù)和臨床病理分型之間的關(guān)系。既往研究發(fā)現(xiàn)，AT1-AA 與AT1受體結(jié)合后既可直接刺激血管平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)游離鈣水平增高、導(dǎo)致血管收縮以及刺激心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率增加，也具有介導(dǎo)心血管重構(gòu)的作用，從而參與惡性高血壓的病變過程［4，13］。在本研究中，我們將惡性高血壓患者排除后發(fā)現(xiàn)，非惡性高血壓組與正常血壓組之間的AT1-AA 陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0. 05);且AT1-AA(+)組與AT1-AA(-)組的SBP 和DBP 進(jìn)行比較，結(jié)果亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，提示非惡性高血壓與AT1-AA 之間可能無明顯相關(guān)性。Fu 等［14］提出，在非惡性高血壓患者中可能存在某種因素，可以增強(qiáng)患者的免疫耐受性，從而負(fù)性調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，而惡性高血壓中則不存在該因素。另外，單因素分析和logistic 回歸分析結(jié)果顯示:一般臨床參數(shù)和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)中，僅性別和血清球蛋白與AT1-AA 的水平具有相關(guān)性。AT1-AA(+)組中女性患者所占比例明顯高于AT1-AA(-)組;同期研究也發(fā)現(xiàn)狼瘡性腎炎患者AT1-AA 陽性比率較正常對(duì)照組也明顯增高［15］。眾所周知，女性自身免疫性疾病(包括狼瘡)的發(fā)病率要高于男性，對(duì)于自身免疫性疾病與性別差異之間關(guān)系的研究前景正越來越受到科學(xué)家們的青睞，兩性之間性激素的不同是產(chǎn)生這種差異的重要原因。AT1-AA 屬于補(bǔ)體結(jié)合性的IgG1和IgG3抗體［14］，我們的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也證實(shí)AT1-AA(+)組的血清球蛋白水平高于AT1-AA(-)組(P ＜0.05)。

不管根據(jù)臨床或病理分類，各類型患者中均檢測(cè)出較高水平的AT1-AA 陽性率，且各組間AT1-AA陽性率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0. 05)。雖然MPGN 患者的AT1-AA 陽性率達(dá)100%，但由于其病例數(shù)僅為2 例，故二者之間的關(guān)系尚有待進(jìn)一步的觀察。臨床分類方面，慢性腎小球腎炎AT1-AA 陽性率最高，急性腎小球腎炎陽性率最低，但差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。故無論從臨床還是病理方面進(jìn)行分型，AT1-AA 似乎都不是某一類型的原發(fā)性腎小球疾病的特異性抗體。

總之，我們通過對(duì)大量原發(fā)性腎小球腎炎患者臨床和病理資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，AT1-AA 可能是參與原發(fā)性腎小球疾病發(fā)病機(jī)制的重要因素。該發(fā)現(xiàn)為腎小球疾病的防治研究提供了新的理論基礎(chǔ)。但目前仍存在很多疑問，如:AT1-AA 與慢性腎小球疾病之間到底誰是因，誰是果，還是互為因果?AT1-AA 致腎小球疾病的發(fā)病機(jī)制是什么?抑制AT1-AA的產(chǎn)生能夠預(yù)防和治療腎小球疾病嗎?這些問題的解答都需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究。

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