針刺對(duì)胚胎著床障礙大鼠CD4 + CD25 + Foxp3 +調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的影響*

高偉娜， 咼 月， 王麗君， 唐 瀟， 劉亞飛， 陳鎮(zhèn)燕， 張明敏， 黃光英

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，湖北 武漢430030)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T-cells，Treg 細(xì)胞)是一類具有免疫抑制作用的T 細(xì)胞。這類細(xì)胞不僅參與自身免疫耐受的調(diào)節(jié)，而且在腫瘤免疫和移植免疫中有重要作用。近年來(lái)在正常妊娠婦女的外周血和蛻膜以及孕鼠的外周血、淋巴結(jié)、脾臟等組織均發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的存在，提示它們?cè)谀柑ッ庖吣褪苤杏兄匾饔茫?-4］。本課題組前期的研究已經(jīng)證實(shí)了針刺能夠提高胚胎著床障礙大鼠的懷孕率和著床胚胎數(shù)［5］。那么，針刺的治療作用是否與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用相關(guān)尚缺乏研究，本文旨在觀察針刺對(duì)胚胎著床障礙大鼠CD4+CD25+Foxp3(forkhead box P3)+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的影響，以探討針刺提高胚胎著床障礙大鼠懷孕率的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物及分組

SPF 級(jí)成年未孕雌性Wistar 大鼠(10 ～12 周，平均體重為220 ～230 g)和有生育能力的成年雄性Wistar 大鼠(250 ～300 g)購(gòu)于湖北省疾病控制中心，許可證號(hào)為SCXK(鄂)2008 -0005。所有大鼠均飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，所有雌性大鼠進(jìn)行陰道涂片觀察動(dòng)情周期，動(dòng)情周期正常者納入本實(shí)驗(yàn)。處于動(dòng)情期的雌性大鼠與雄性大鼠以2∶1 的比例于每日下午6:00 進(jìn)行交配，次日早上8:00 行大鼠陰道涂片，發(fā)現(xiàn)有大量精子者視為懷孕，當(dāng)天記為妊娠第1 天。然后將妊娠大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(N)和米非司酮組(M)、米非司酮+針刺組(A)和米非司酮+黃體酮組(W)，每組36 只，每組孕鼠根據(jù)處死的時(shí)間隨機(jī)再分為6 d 組、8 d 組和10 d 組。

2 試劑與儀器

米非司酮片(夕韻，湖北葛店人福藥業(yè))和黃體酮注射液(浙江仙琚藥業(yè))由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院提供。IV 型膠原酶和透明質(zhì)酸酶購(gòu)于Sigma。大鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于北京達(dá)科為公司。RPMI-1640 培養(yǎng)基來(lái)自中國(guó)賽默飛世爾生物科技有限公司。胎牛血清來(lái)自杭州四季青生物工程材料有限公司。FITC 標(biāo)記的抗大鼠CD4 抗體、PE 標(biāo)記的抗大鼠CD25 抗體、Alexa Fluor? 647 標(biāo)記的抗大鼠Foxp3 抗體和Alexa Fluor? 647 小鼠IgG1κ 亞型對(duì)照抗體購(gòu)于BioLegend。Foxp3 固定破膜試劑盒和抗大鼠多克隆抗體Foxp3 購(gòu)于eBioscience。HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG 和山羊或兔抗大鼠β-actin 多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz。RIPA裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒和超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技研究所。Cocktail蛋白酶抑制劑購(gòu)于Roche。硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜購(gòu)自Pierce。引物、TRIzol RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR 熒光定量試劑盒購(gòu)于TaKaRa。主要設(shè)備:DU730 核酸蛋白質(zhì)分析儀(Beckman Coulter)，PCR 儀(Eppendorf Company)，熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems)，全能酶標(biāo)儀(BioTek)，流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)。

3 造模與處理

在超凈工作臺(tái)中將米非司酮研磨成粉末后溶于適量體積的麻油中，配置成2 g/L 的米非司酮麻油溶液，分裝后置于4 ℃冰箱中備用。M 組、A 組和W 組孕鼠在妊娠第1 天上午9:00 于頭頸部皮下注射米非司酮麻油溶液(5.5 mg/kg)，N 組則給予同量的純麻油溶液。同時(shí)各組大鼠從妊娠第1 天直至處死當(dāng)天予以治療或?qū)φ仗幚怼Ｃ刻煜挛绻潭〞r(shí)點(diǎn)A 組孕鼠用自制布袋給予固定，并針刺后三里和三陰交25 min，每5 min 行針1 次，穴位的定位和進(jìn)針深度參考前期的研究［5］;M 組和N 組孕鼠僅固定不予針刺;W組孕鼠則每日肌肉注射黃體酮(40 mg/kg)。

4 取材

各組孕鼠在1%戊巴比妥鈉的麻醉下行剖腹，觀察胚胎著床情況，并記錄胚胎數(shù)。用肝素鋰抗凝管腹主動(dòng)脈取血2 mL 置于4 ℃冰箱備用。2/3 子宮組織被收集，立即放入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中用于后續(xù)的流式檢測(cè)，剩余的子宮組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5 外周血和著床點(diǎn)子宮淋巴細(xì)胞的提取和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的流式檢測(cè)

取肝素鋰抗凝的大鼠外周血1 mL，并用等體積的PBS 稀釋，緩慢加入2 mL 的淋巴細(xì)胞分離液之上，以2 000 ×g、22 ℃離心30 min。收集白色云霧狀的淋巴細(xì)胞層，PBS 充分洗滌，細(xì)胞重懸。

在解剖顯微鏡下，將收集的新鮮的子宮組織沿子宮系膜對(duì)側(cè)打開(kāi)，分離出胎兒，收集著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜。收集的組織在PBS 中漂洗后，剪成體積為1 mm×1 mm ×1 mm 小塊組織，加入0.1% IV 型膠原酶和0.1%透明質(zhì)酸酶在37 ℃恒溫箱中輕微振蕩消化2 h。用200 目的不銹鋼篩網(wǎng)去除未消化組織，收集的濾液以1 500 ×g 室溫下離心5 min。用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液小心平鋪于淋巴細(xì)胞分離液之上，以2 000 × g、22 ℃離心30 min。收集白色云霧狀的淋巴細(xì)胞層，PBS 充分洗滌。臺(tái)盼藍(lán)染色，收集的細(xì)胞大于95%的活細(xì)胞率可用于后續(xù)的流式檢測(cè)。由于單個(gè)標(biāo)本收集的淋巴細(xì)胞大約有1 ×107/L，所以我們通常將來(lái)自同組的2個(gè)標(biāo)本的淋巴細(xì)胞合并為1 個(gè)檢測(cè)樣本。

調(diào)整外周血和子宮內(nèi)膜的淋巴細(xì)胞濃度為每管1 ×109/L。每管加入CD4-FITC 和CD25-PE 抗體，4 ℃避光孵育30 min。PBS 洗滌后，進(jìn)行固定破膜。然后，每管加入Foxp3-Alexa Fluor? 647 抗體，4 ℃避光孵育30 min。Alexa Fluor? 647 小鼠IgG1κ 亞型作為同型對(duì)照抗體。洗滌后，200 μL PBS 重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞和子宮內(nèi)膜CD4+Foxp3+Treg 細(xì)胞的百分比用WinMDI 2.9 軟件分析獲得。

6 妊娠大鼠著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白的檢測(cè)(Western blotting)

著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜被剪碎后放于預(yù)冷的RIPA 裂解液中在冰上研磨成勻漿狀。冰上靜置30 min。然后4 ℃、12 000 ×g 離心20 min。上清被收集分裝放于-80 ℃冰箱中。蛋白濃度用BCA 試劑盒定量，酶標(biāo)儀分析。將加了上樣緩沖液的蛋白98 ℃蒸煮10 min 后，加入10%SDS-PAGE 中電泳，然后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上。5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h后，Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜(β-actin 1 ∶200;Foxp3 1∶500)。漂洗后，HRP 標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(1∶20 000)室溫下孵育1 h。然后根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ECL 曝光。掃描膠片，用Quantity One 軟件獲得積分光密度值。每個(gè)樣本的蛋白表達(dá)水平以目的蛋白/β-actin 的吸光度比值來(lái)表示。

7 妊娠大鼠著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜Foxp3 mRNA 的檢測(cè)(real-time PCR)

按照說(shuō)明書(shū)，將剪碎的著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜置于預(yù)冷的TRIzol 中提取RNA。取2 μL RNA 用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度后，用PrimeScript RT reagent Kit 將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為:37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃穩(wěn)定儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中。然后在20 μL 體系下進(jìn)行擴(kuò)增:10 μL SYBR Premix Ex Taq(2 ×)，2 μL cDNA 樣品，10 μmol/L 的引物各0.4 μL(引物序列詳見(jiàn)表1)，0.4 μL ROX Reference Dye(50 ×)，6.8 μL 無(wú)菌DECP 水。反應(yīng)條件為:95℃30 s，1 個(gè)循環(huán);95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán);95℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，1 個(gè)循環(huán)。其中每個(gè)樣本做2 個(gè)復(fù)孔，β-actin 為內(nèi)參照。每個(gè)標(biāo)本的相對(duì)mRNA 含量通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算得到。

表1 Foxp3 和β-actin 的引物序列Table 1. The primer sequences of Foxp3 and β-actin

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時(shí)，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理(數(shù)據(jù)滿足方差齊性條件選擇LSD 檢驗(yàn)，如果不滿足，則用Dunnett’s T3 檢驗(yàn));數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布時(shí)，則用非參數(shù)Kruskal-Wallis 和Mann-Whitney U-tests 檢驗(yàn);以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組妊娠大鼠平均著床胚胎數(shù)比較

如表2 所示，與N 組相比，M 組的著床胚胎數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);而與M 組相比，A 組和W 組的著床胚胎數(shù)顯著增多(P ＜0.05)。

表2 大鼠妊娠第8、10 天的著床胚胎數(shù)Table 2. The number of implanted embryos in rats on day 8 and day 10 of pregnancy(mean±SD.n=24)

2 各組妊娠大鼠外周血CD4+淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞的比例

與N 組相比，M 組大鼠妊娠第6、8、10 天外周血CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞/CD4+細(xì)胞的比例顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與M 組相比，A組和W 組大鼠妊娠第6、8、10 天外周血CD4+T 細(xì)胞中表達(dá)CD25+Foxp3+的頻率明顯增高(P ＜0.05);A組與W 組之間CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的比例無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，見(jiàn)圖1。

3 各組妊娠大鼠子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞中CD4+Foxp3+Treg 細(xì)胞的比例

妊娠大鼠子宮內(nèi)膜Treg 細(xì)胞的相對(duì)含量通過(guò)CD4+Foxp3+細(xì)胞/淋巴細(xì)胞來(lái)表示。如圖2 所示，M組大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞中CD4+Foxp3+Treg 細(xì)胞的百分比顯著低于N 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與M 組相比，W 組大鼠妊娠第6、8、10 天和A 組大鼠妊娠第8、10 天子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞中CD4+Foxp3+Treg 細(xì)胞的比例均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，而A 組大鼠妊娠第6天子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞中CD4+Foxp3+Treg 細(xì)胞的比例差異雖未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也有一定程度的增高趨勢(shì);A 組與W 組之間CD4+Foxp3+Treg 細(xì)胞的比例無(wú)明顯差異(P ＞0.05)。

Figure 2. The percentage of CD4 +Foxp3 +Treg cells in rat endometrium on day 6，day 8 and day 10 of pregnancy detected by flow cytometry.Mean±SD. n=6. * P ＜0.05 vs group N;#P ＜0.05 vs group M.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內(nèi)膜CD4 +Foxp3 +Treg 細(xì)胞的比例

4 各組妊娠大鼠著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白的表達(dá)

與N 組相比，M 組大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與M 組相比，A 組大鼠妊娠第6、8 天子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白的表達(dá)和W 組大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白的表達(dá)均顯著上升(P ＜0.05)，而A 組大鼠妊娠第10 天子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白的表達(dá)未達(dá)到顯著差異;A 組與W 組之間Foxp3蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The expression of Foxp3 protein in rat endometrium on day 6，day 8 and day 10 of pregnancy detected by Western blotting. Mean ± SD. n = 6. * P ＜0.05 vs group N;#P ＜0.05 vs group M.圖3 Western blotting 檢測(cè)大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白的表達(dá)

5 各組妊娠大鼠著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜Foxp3 mRNA 的表達(dá)

與N 組相比，M 組大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內(nèi)膜Foxp3 mRNA 的表達(dá)明顯下降(P ＜0.05);與M組相比，A 組大鼠妊娠第6、10 天和W 組大鼠妊娠第6、8 天子宮內(nèi)膜Foxp3 mRNA 表達(dá)均顯著增高(P ＜0.05);A 組與W 組之間Foxp3 mRNA 的表達(dá)無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，見(jiàn)圖4。

討 論

Figure 4. The expression of Foxp3 mRNA in rat endometrium on day 6，day 8 and day 10 of pregnancy detected by real-time PCR.Mean±SD.n =6. * P ＜0.05 vs group N;#P ＜0.05 vs group M.圖4 Real-time PCR 檢測(cè)大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內(nèi)膜Foxp3 mRNA 表達(dá)

在懷孕過(guò)程中，作為半同種移植物的孕體要想順利在子宮內(nèi)膜著床和生長(zhǎng)發(fā)育并非易事，需要應(yīng)對(duì)母體先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的免疫排斥［6］。在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中，母體淋巴細(xì)胞不是被屏蔽，而是時(shí)刻準(zhǔn)備著與父系的MHC 和其它孕體抗原反應(yīng)［7］。為了阻止應(yīng)答的淋巴細(xì)胞對(duì)孕體的細(xì)胞毒性損傷，母體的免疫耐受被激活。這種免疫耐受一定程度上由CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)［1］。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是一個(gè)獨(dú)特的T細(xì)胞亞型，主要來(lái)源于胸腺，能夠有力地抑制炎癥I型免疫反應(yīng)的產(chǎn)生和功能發(fā)揮。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞有無(wú)能性和免疫抑制性兩大功能特點(diǎn)。Foxp3 特異表達(dá)在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞上，對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分化發(fā)育和功能至關(guān)重要［8］。妊娠期的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞大部分是Foxp3 陽(yáng)性細(xì)胞［3］。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在正常妊娠生理中是必須的。人類妊娠早期外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞開(kāi)始增加，在妊娠中期達(dá)到高峰，以后逐步下降，產(chǎn)后下降至稍高于懷孕前水平［2-3］。在流產(chǎn)和不明原因的自發(fā)性流產(chǎn)婦女的子宮內(nèi)膜中存在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞數(shù)量下降［9］和調(diào)節(jié)異常［10］。懷孕早期的婦女蛻膜中Foxp3+細(xì)胞明顯增加［11］，而在不明原因的不孕婦女中分泌期子宮內(nèi)膜Foxp3 mRNA 的表達(dá)是降低的，子宮內(nèi)膜Foxp3 mRNA 的表達(dá)下降可能減弱子宮CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，從而導(dǎo)致著床失?。?2］。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在妊娠中的作用同樣在鼠類中得到證實(shí)。Aluvihare 等［1］觀察到妊娠期的C57BL/6 小鼠的脾臟、腹股溝淋巴結(jié)和血液中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞明顯高于未孕者。有流產(chǎn)傾向的CBA/J 雌鼠懷孕后，子宮內(nèi)膜組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞減少且自發(fā)流產(chǎn)率升高，但是通過(guò)來(lái)自正常懷孕小鼠的Treg 細(xì)胞的過(guò)繼移植，可使CBA/J 雌鼠蛻膜組織中Foxp3 mRNA 水平升高，同時(shí)降低了胎兒自發(fā)流產(chǎn)率［13］。上述研究表明CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是成功妊娠的重要調(diào)節(jié)者。

在本研究中，我們統(tǒng)計(jì)了各組大鼠妊娠第8、10天的著床胚胎數(shù)。M 組大鼠的著床胚胎數(shù)明顯低于N 組，而A 組大鼠的著床胚胎數(shù)則明顯高于M 組，表明我們成功建立了胚胎著床障礙模型，同時(shí)再次證實(shí)了針刺對(duì)大鼠胚胎著床障礙有改善作用。此外，我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了各組孕鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞和著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜CD4+Foxp3+Treg 細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示:M 組大鼠妊娠第6、8、10 天 外 周 血CD4+T 細(xì) 胞 中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例明顯低于N 組，而A 組大鼠妊娠第6、8、10 天 外 周 血CD4+T 細(xì) 胞 中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例明顯高于M 組，且與W 組相比無(wú)明顯差異;M 組大鼠妊娠第6、8、10 天著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜CD4+Foxp3+細(xì)胞的比例明顯低于N 組，而A 組大鼠妊娠第6、8、10 天著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜CD4+Foxp3+細(xì)胞的比例不同程度地高于M 組，且與W 組之間無(wú)明顯差異。這說(shuō)明針刺不僅提高了胚胎著床障礙大鼠外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比例，而且也在一定程度上提高了著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比例。我們進(jìn)一步研究了著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白和mRNA 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)M 組大鼠妊娠第6、8、10 天著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白和mRNA 的表達(dá)明顯低于N 組，而A組大鼠妊娠第6、8、10 天著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜Foxp3 蛋白和mRNA 的表達(dá)不同程度地高于M 組，且與W 組相比無(wú)明顯差異。這證明了Foxp3 在大鼠妊娠早中期的重要作用，同時(shí)也表明針刺可能促進(jìn)Foxp3 在著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜上的表達(dá)，這也為針刺能夠促進(jìn)Treg 細(xì)胞在大鼠子宮內(nèi)膜上的分布和功能的發(fā)揮提供了更多的證據(jù)。Polanczyk 等［14］和Prieto 等［15］認(rèn)為雌激素能增加體內(nèi)外Foxp3 的表達(dá)以及CD4+CD25+細(xì)胞的數(shù)量和功能。另外，最近也有研究顯示，孕酮能夠使培養(yǎng)的CD4+CD25-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+細(xì)胞，孕酮拮抗劑RU486(米非司酮)抑制這種轉(zhuǎn)化;當(dāng)卵巢切除小鼠和假孕模型小鼠被給予孕酮后，這種轉(zhuǎn)化仍被抑制;孕酮通過(guò)細(xì)胞核孕激素受體使Treg 細(xì)胞增加［16］。這說(shuō)明雌、孕激素在CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞發(fā)育和功能發(fā)揮中起重要作用。Treg 細(xì)胞主要來(lái)源于胸腺，子宮內(nèi)膜局部的Treg 細(xì)胞有可能是從外周募集過(guò)來(lái)的，因此我們推測(cè)針刺可能通過(guò)調(diào)節(jié)激素的變化，提高大鼠外周血Treg 細(xì)胞的比例，促使這些細(xì)胞在著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜的聚集，從而使調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞免疫耐受功能得到發(fā)揮，進(jìn)而維持妊娠的順利進(jìn)行。

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