大黃素阻抑人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程*

李夢(mèng)佳， 馬蓮順， 楊亞萍， 朱瑋瑋， 陳麗新， 王立偉， 朱林燕△， 楊海峰

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，2分析測(cè)試中心，3醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，廣東 廣州510632;4廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院病理科，廣東 廣州510120)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)我 國(guó)乳腺癌發(fā)病率增高，逐漸成為嚴(yán)重威脅女性健康的嚴(yán)重疾病。乳腺癌的治療手段以手術(shù)和化療為主，然而腫瘤對(duì)傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化療藥物產(chǎn)生耐藥從而導(dǎo)致化療失敗是目前乳腺癌藥物治療較為突出的問(wèn)題。大黃素(emodin)是從中藥材大黃中提取的一種天然的蒽醌類衍生物，是大黃、虎杖、何首烏等多種中藥的有效活性成分。大黃素因其多重的生物學(xué)活性(如血管舒張、免疫抑制、保護(hù)肝臟、抗腫瘤作用)，得到廣泛的關(guān)注［1］。大黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖均有顯著的抑制作用，如人肺癌A549 細(xì)胞、髓系白血病HL-60 細(xì)胞、肝癌SMMC-7721 細(xì)胞等，是一種潛在的抗腫瘤藥物［2-4］。但國(guó)內(nèi)鮮有大黃素抗乳腺腫瘤方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用藥后腫瘤細(xì)胞周期及凋亡的變化情況，并采用原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)觀察細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的改變來(lái)研究大黃素的抗腫瘤作用，從而為大黃素治療乳腺癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要藥物、試劑和儀器

大黃素(廣東省食品藥品檢驗(yàn)所);MTT(sigma);DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)，10% 胎牛血清(Gibco);Annexin V-PI 凋亡試劑盒(南京凱基生物科技有限公司);AFM(BioScope Catalyst ScanAsyst，Bruker);流式細(xì)胞儀(FACS Aria，BD)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7 接種于含10%胎牛血清、青霉素(1 ×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的DMEM 培養(yǎng)基中，置5%CO2、37 ℃的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每3 d 傳代。用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT 法檢測(cè)大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按每孔4 ×103個(gè)接種96 孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 ～18 h 后，加入不同濃度的大黃素(μmol/L):0、6.25、12.5、25、50和100，每組均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h加入MTT (終濃度0.5 g/L)，置于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加DMSO 100 μL，水平搖床振蕩使細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解。10 min 后酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(A570)。按以下公式計(jì)算大黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1 -加藥組細(xì)胞A 值/對(duì)照組細(xì)胞A 值)×100%，繪制量效曲線并計(jì)算IC50值。

2.3 細(xì)胞周期變化及凋亡率的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)分析。設(shè)定空白組和大黃素組，收集經(jīng)大黃素作用48 h 后的MCF-7 細(xì)胞，PBS 緩沖液洗滌2 次，離心去上清，加入4 ℃預(yù)冷的95%乙醇，4 ℃固定過(guò)夜，離心后棄上清液，PBS 洗1 次，加PI 染色劑避光染色15 ～20 min，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的變化及凋亡率。

2.4 Annexin V/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 設(shè)定空白組和大黃素組，48 h 后收集MCF-7 細(xì)胞，PBS 緩沖液洗滌2 次(4 ℃)，按照試劑盒的說(shuō)明加入Annexin V-FITC，混勻室溫避光孵育10 min，離心重懸后加入PI，用流式細(xì)胞術(shù)分析。細(xì)胞凋亡率(%)=Annexin V+PI-細(xì)胞百分比+Annexin V+PI+細(xì)胞百分比。

2.5 AFM 樣品制備及成像 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×108/L，接種于6 孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，設(shè)定空白組、大黃素組，48 h 后用PBS 洗滌MCF-7 細(xì)胞并重懸，滴于玻片上，自然鋪展，吸附2 h。后用pH 7.4 PBS 緩沖液沖洗，用1% 戊二醛溶液固定15 min，用蒸餾水沖洗3 次，室溫自然晾干后上機(jī)觀察。利用Olympus 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的分散情況，用AFM 對(duì)樣品進(jìn)行掃描成像。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞核高度，反映經(jīng)藥物作用后細(xì)胞核是否發(fā)生坍塌腫脹等變化，并利用Nanoscope Analysis 軟件分析細(xì)胞膜表面的粗糙程度，反映細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的變化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大黃素抑制MCF-7 細(xì)胞增殖

48 h 后對(duì)照組每孔細(xì)胞大約鋪滿80%，細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，分布均勻，狀態(tài)良好。大黃素呈劑量依賴性抑制MCF-7 細(xì)胞增殖，當(dāng)藥物濃度為12.5 μmol/L時(shí)，生長(zhǎng)抑制率為(13.65 ±0.36)%，與對(duì)照組相比差異顯著(P ＜0.05)，當(dāng)藥物濃度為100 μmol/L，生長(zhǎng)抑制率高達(dá)(74.61 ±3.63)%。非線性回歸分析得出大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖抑制的IC50值為50.55 μmol/L，見(jiàn)圖1B，因此選用大黃素濃度50 μmol/L 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1. Effects of emodin on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells (MCF-7). A:effect of emodin on the viability of MCF-7 cells;B:inhibition of MCF-7 cell proliferation by emodin.Mean±SD. n=3. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖1 大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖的影響

2 大黃素阻抑MCF-7 細(xì)胞于G0/G1 期

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明大黃素可阻抑MCF-7細(xì)胞于G0/G1期(圖2)，MCF-7 細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L 大黃素作用48 h 后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量達(dá)(73.15 ±0.07)%，與對(duì)照組［(52.55 ±3.61)］%比較差異顯著(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。而S 期的細(xì)胞數(shù)量?jī)H(15.95±2.76)%，與對(duì)照組［(35.65 ±6.71)%］比較f 顯著降低(P ＜0.05)。此外，圖2 中G0/G1期峰前并沒(méi)有明顯的亞峰，提示大黃素可能對(duì)MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響較小。

Figure 2. Effects of emodin on the cell cycle distribution of MCF-7 cells.A:control;B:emodin (50 μmol/L).圖2 大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞周期分布的影響

表1 大黃素阻滯MCF-7 細(xì)胞周期于G0/G1 期Table 1. Emodin induced cell cycle arrest at G0/G1 phase (%.Mean±SD.n=3)

3 大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響

進(jìn)一步用Annexin V/PI 雙染法檢測(cè)大黃素是否可誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞的凋亡。50 μmol/L 大黃素作用48 h，細(xì)胞的凋亡率為(6.35 ±1.93)%，與對(duì)照組細(xì)胞［(3.46 ±2.23)%］相比無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3。

4 大黃素影響MCF-7 細(xì)胞膜的超微結(jié)構(gòu)

應(yīng)用AFM 掃描成像，獲得了各組單個(gè)細(xì)胞的超微形貌圖和三維結(jié)構(gòu)圖。對(duì)照組的細(xì)胞鋪展的舒展，核區(qū)飽滿，膜表面平坦光滑，見(jiàn)圖3A、B;與對(duì)照組相比，50 μmol/L 大黃素作用48 h 后MCF-7 細(xì)胞形態(tài)明顯不同，細(xì)胞逐漸萎縮，偽足數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核明顯坍塌，細(xì)胞表面粗糙，核區(qū)高度明顯降低，見(jiàn)圖3D、E;利用Nanoscope Analysis 軟件測(cè)量核區(qū)高度:對(duì)照組細(xì)胞的核高度顯著高于加藥組(P ＜0.05)，見(jiàn)圖3C、F。

Figure 3. Effect of emodin on the apoptosis of MCF-7 cells.A:control;B:emodin (50 μmol/L).圖3 大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. AFM morphological images of MCF-7 cells treated with 50 μmol/L emodin for 48 h. A ～C:control;D ～F:50 μmol/L emodin. A，D:three-dimensional morphological images (60 μm ×60 μm);B，E:ultrastructure (2 μm ×2 μm);C，F(xiàn):the height profiles at the lines indicated in A，D.圖4 大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步探索大黃素對(duì)細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的影響，通過(guò)Nanoscope Analysis 軟件測(cè)量得到三維結(jié)構(gòu)參數(shù)值:細(xì)胞膜表面的平均粗糙度(average roughness，Ra)和均方粗糙度(root mean square roughness，Rq)。大黃素組的細(xì)胞表面褶皺增多，粗糙度明顯增大，其Rq［(50.12 ± 11.11)nm］和Ra ［(40.61 ±9.30)nm］，與對(duì)照組的Rq［(29.39 ±6.09)nm］和Ra［(22.51 ± 4.64)nm］比較有顯著差異(P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的影響Table 2. Ultrastructural parameters of MCF-7 cells treated with emodin (nm.Mean±SD.n=9)

討 論

大黃素是從大黃中提取的一種天然的蒽醌類衍生物，是蓼科大黃屬植物的根及根狀莖中的活性成分，也是大黃中的主要有效成分，其藥理作用廣泛［5］。近年來(lái)，大黃素在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用受到關(guān)注。Kawai 等［6］首先發(fā)現(xiàn)大黃素能夠抑制小鼠白血病L1210 細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨后發(fā)現(xiàn)大黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用，但其抗腫瘤的機(jī)制并不相同。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用藥后腫瘤細(xì)胞周期及凋亡情況，并采用AFM 觀察大黃素對(duì)細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明大黃素對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，存在一定的量效關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道，大黃素通過(guò)將人胃癌SCG-7901 細(xì)胞阻滯于G2/M 期并誘導(dǎo)其凋亡來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用［7］，而對(duì)于人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞，大黃素則將其細(xì)胞周期阻滯于S 期來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用［8］。進(jìn)一步探討大黃素抑制MCF-7 細(xì)胞增殖的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，大黃素可阻抑MCF-7 細(xì)胞的細(xì)胞周期于G0/G1期，而Annexin V/PI 雙染結(jié)果顯示大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞無(wú)明顯誘導(dǎo)凋亡的作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大黃素主要通過(guò)影響細(xì)胞周期從而抑制MCF-7 細(xì)胞的增殖。

AFM 具有高分辨率、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)原子動(dòng)顯微鏡亦用于腫瘤細(xì)胞的成像研究，可作為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡以及評(píng)估抗腫瘤藥物療效的工具。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)AFM 觀察大黃素對(duì)MCF-7 細(xì)胞超微形貌的影響，進(jìn)一步在單細(xì)胞水平上明確大黃素是否具有抗腫瘤作用。結(jié)果顯示，大黃素作用后，細(xì)胞逐漸萎縮，核區(qū)發(fā)生明顯坍塌。細(xì)胞周圍的絲狀偽足也開(kāi)始減少，說(shuō)明大黃素作用于細(xì)胞后，可能干擾了細(xì)胞的侵襲作用，減弱了細(xì)胞間的信息傳遞。而且大黃素作用后，細(xì)胞膜表面的粗糙度與對(duì)照組相比明顯增加。粗糙度是細(xì)胞形貌的超微結(jié)構(gòu)重要參數(shù)之一，已證實(shí)細(xì)胞表面粗糙度的大小與細(xì)胞骨架的完整性及細(xì)胞表面糖基蛋白等變化相關(guān)［9］，我們推測(cè)粗糙度的增加可能是藥物作用于細(xì)胞膜表面分子，使細(xì)胞的骨架發(fā)生重排，導(dǎo)致細(xì)胞呈現(xiàn)不同的形貌，而這些形貌變化又與細(xì)胞黏附、增殖等特性密切相關(guān)［10-12］。通過(guò)AFM 得到的數(shù)據(jù)在納米級(jí)水平上為揭示細(xì)胞的生理病理狀態(tài)提供了可視化依據(jù)，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)通過(guò)單細(xì)胞診斷癌癥提供有用的數(shù)據(jù)支持。

我們的實(shí)驗(yàn)表明，大黃素可通過(guò)影響細(xì)胞周期、破壞細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)而對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞有顯著的殺傷作用，為臨床應(yīng)用大黃素治療乳腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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