阿托伐他汀對碘普羅胺引起的糖尿病大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響*

鄒文博， 蘇津自， 許昌聲， 蔡文欽， 馬雯雯， 陳秀平， 王芳兵

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1高血壓研究所，2心血管內(nèi)科，福建 福州350005;3華中科技大學同濟醫(yī)學院，湖北 武漢430030)

隨著各種影像學檢查和介入診療技術的發(fā)展，含碘造影劑的使用日益頻繁，造影劑急性腎損傷(contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI)的發(fā)病率隨之增加。CI-AKI 已經(jīng)成為醫(yī)源性急性腎功能不全的第三大原因，在急性腎功能損害病例中，大約有10%是由CI-AKI 引起的［1］。此外，CI-AKI 可增加心腦血管事件的發(fā)生率和死亡率，加重靶器官的損傷，并帶來延長住院時間和增加診療費用等諸多問題［2］。CI-AKI 的危險因素已被廣泛地研究和報道，其中糖尿病被公認為CI-AKI 的重要獨立危險因素之一，在接受介入治療的正常人群中，CI-AKI 發(fā)病率不足1%，而在糖尿病人群中高達29.4%［3］。一項隨訪研究［4］顯示，有糖尿病基礎疾病的CI-AKI 患者，其2 年生存率比CI-AKI 無糖尿病的患者明顯降低。因此，如何有效地預防糖尿病人群中CI-AKI 的發(fā)生和發(fā)展，成為了介入科醫(yī)師與腎內(nèi)科醫(yī)師共同面臨的課題。目前他汀類藥物是否對CI-AKI 有保護作用目前仍存在爭議，為此我們在糖尿病的基礎上，建立了CI-AKI 的動物模型，初步探討阿托伐他汀對糖尿病CI-AIK 是否有保護作用及可能存在的機制。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級Wistar 大鼠(250 ～300 g)購自上海斯萊克實驗動物中心(No. SCXK2007-0005)。實驗大鼠每籠4 ～5 只，飼養(yǎng)在恒溫(22 ±2)℃、恒濕(55 ±5)%，人工光照明暗各12 h 的飼養(yǎng)室內(nèi)，標準飼料和自來水自由飲食。

2 主要方法

2.1 模型建立與分組 60 只清潔級Wistar 大鼠隨機分為正常組(N 組，n =8)及糖尿病造模組(n =52)，適應性喂養(yǎng)2 周后，造模組以腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ;Sigma)40 mg/kg(溶解在10 mmol/L 枸櫞酸緩沖液中，pH 4.2 ～4.5)建立糖尿病模型，分別于72 h、5 d 和1 周后斷尾取血測血糖，以非禁食血糖≥16.7 mmol/L 為標準確定糖尿病大鼠模型是否成功，對于血糖未達標大鼠，給予40 mg/kg 的追加劑量至達標。普通飲食、自由攝水飼養(yǎng)8 周后，選取糖尿病模型成功者，隨機分為糖尿病對照組(DM 組)、糖尿病+ 造影劑組(DM + CM組)、糖尿病+造影劑+5 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀組(ATO1 組)、糖尿病+造影劑+10 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀組(ATO2 組)和糖尿病+造影劑+30 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀組(ATO3 組)。將阿托伐他汀鈣片(輝瑞公司)研磨后與2 mL 飲用水混合成混懸液，分別以5、10 和30 mg·kg-1·d-1灌胃，N 組、DM 組和CM 組給予同體積飲用水連續(xù)灌胃5 d。灌胃5 d 后 以12 mL/kg 單次劑量經(jīng)尾靜脈注射碘普羅胺注射液，N 組和DM 組分別給予同體積的生理鹽水。

2.2 標本收集 注射造影劑24 h 后，用代謝籠收集24 h 尿液，離心后取上清測尿肌酐和尿微量白蛋白;注射造影劑48 h 后，處死動物，經(jīng)腹主動脈收集血標本并摘取左腎，稱重，并計算腎指數(shù)［腎重(kidneyweight，KW)/體重(body weight，BW)］;血液標本離心后，取上清，測血清肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN);左腎部分置于10%甲醛溶液中固定，待作光鏡檢查及相關的組織學檢查。其余腎臟標本待分離出皮質和髓質后，置于-80 ℃冰箱保存，待測腎臟Bax 和Bcl-2 蛋白的表達。

2.3 血糖檢測 血糖采用斷尾取血法，應用血糖試紙和血糖儀(拜安捷公司)測定。

2.4 生化指標測定 SCr、BUN、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、尿肌酐(urine creatinine，UCr)和24 h 尿微量白蛋(24-hour urine albumin，24 h-UAlb)等指標由福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科日立7150 型全自動生化分析儀檢測;并計算肌酐清除率(creatinine clearance rate，CCr)和24 h 尿微量白蛋白排泄率(24-hour urinary albumin excretion rate，24 h-UAER)。CCr=U×V/P，U 表示尿肌酐含量(μmol/L)，V 表示尿量［mL·min-1·(100 g)-1］，P 表示血肌酐水平(μmol·L-1)，CCr單位為mL·min-1·(100 g)-1;24 h-UAER= 24 h-UAlb/(24 ×60)，24 h-UAER 單位為μg·min-1。

2.5 形態(tài)學觀察 將固定于10%甲醛中的腎組織，經(jīng)石蠟包埋后切成3μm 厚的切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇進水，水沖洗后于蘇木素液浸泡10 ～20 min;水沖洗;1%鹽酸乙醇分化;1% 氨水還原;1%伊紅浸泡10 min;水沖洗;梯度乙醇脫水;二甲苯透明2 h;環(huán)氧樹脂封片。在光學顯微鏡下雙盲觀察，每張切片于400 倍顯微鏡下隨機選取10 個腎小管間質視野，進行腎小管損傷程度評分，評分標準如下:0 分，腎小管正常，無損傷;1 分，腎小管輕度損傷(受損腎小管＜25%);2 分，腎小管中度損傷(受損腎小管25% ～75%);3 分，腎小管重度損傷(受損腎小管＞75%)。以每張切片10 個視野評分總和的均值作為腎小管損傷評分。

2.6 TUNEL 定量分析 按Dead EndTMColorimetric TUNEL System 試劑盒(羅氏公司)說明書進行操作。每組每只大鼠隨機選取5 個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)TUNEL 陽性腎小管上皮細胞數(shù)，計算其凋亡率。

2.7 免疫組織化學二步法檢測腎臟Bax 和Bcl-2 表達 石蠟包埋的腎組織進行3 μm 厚的連續(xù)切片，脫蠟水化;3%過氧化氫-甲醇溶液室溫孵育30 min，Ⅰ抗(兔抗Bax 和Bcl-2 抗體，均1∶1 000;Cell Signaling Technology)4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗聚合物室溫孵育30 min，DAB 染色1 min，蘇木素復染2 min，脫水，透明，封固。

2.8 Western blotting 法測定腎臟Bax 和Bcl-2 表達

分組處理細胞后提取各組腎臟組織蛋白，取20 μL 10% SDS-PAGE 凝膠電泳(120 mV)分離蛋白，繼之80 mA轉膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Ⅰ抗(兔抗Bax 和Bcl-2 抗體，均1∶1 000;Cell Signaling Technology)4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗(HRP 標記羊抗兔IgG)37 ℃孵育1 h，化學發(fā)光1 min，顯影，定影，于凝膠成像系統(tǒng)進行目的蛋白及內(nèi)參照條帶β-actin 灰度分析，各蛋白的表達強度為二者灰度的比值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 軟件包分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean ± SD)表示，組間比較采用One-way ANOVA 分析，LSD 法進行多重比較。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠一般情況比較

各組間體重、腎重、ALT 和ALT 均無顯著變化(P ＞0.05);與N 組比較，各組糖尿病大鼠的血糖水平均有明顯升高(P ＜0.01)，但各組糖尿病大鼠血糖水平無明顯差異(P ＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠基本情況比較Table 1. Comparison of basic information in each group (Mean±SD.n=8)

2 各組SCr、CCr、BUN 和24 h-UAER 水平

與N 組比較，DM 組SCr、CCr、BUN 和24 h-UAER 水平升高(P ＜0.05);與N 組和DM 組比較，DM+CM 組SCr、BUN 和24 h-UAER 水平升高(P ＜0.05)，CCr 水平降低(P ＜0.05);與DM +CM 組比較，3 種劑量他汀治療組Scr 均有明顯下降(P ＜0.05)，且ATO3 組較ATO1 和ATO2 組均有明顯下降(P ＜0.05);ATO2 和ATO3 組CCr 水平隨劑量增加均有明顯升高(P ＜0.05)，且ATO2 與ATO3 組間有顯著差異(P ＜0.05);ATO2 及ATO3 組BUN 和24 h-UAER 水平較DM+CM 組明顯降低(P ＜0.05)，見圖1。

Figure 1. Comparisons of SCr，CCr，24 h-BUNR and UAE levels in each group. Mean ±SD. n =8. * P ＜0.05 vs N;#P ＜0.05 vs DM;△P ＜0.05 vs DM+CM;▲P ＜0.05 vs ATO1;◆P ＜0.05 vs ATO2.圖1 各組大鼠SCr、CCr、BUN 及24 h-UAER 水平比較

3 病理形態(tài)學改變

如圖2 所示，CI-AKI 的病理變化主要在髓質區(qū)。與N 組和DM 組比較，DM +CM 組髓質區(qū)出現(xiàn)較多的小管上皮細胞脫落、壞死，炎癥浸潤及空泡樣改變，部分管腔出現(xiàn)蛋白管型、細胞管型，甚至閉塞變形;ATO2 及ATO3 組與DM+CM 組比較，上述病理改變明顯減輕。與N 組和DM 組比較，DM +CM 組病理評分均高于前兩者(P ＜0.05);與DM+CM 組、ATO1 組和ATO2 組比較，ATO3 病理評分較三者低(P ＜0.05);而ATO1 與DM +CM 組評分未見明顯差異(P ＞0.05)。

Figure 2. Analysis of histological changes in each group (HE staining，×200). A:N;B:DM;C:DM + CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. ▲:protein casts;↑:tubular vacuolar degeneration;△:infiltration of inflammatory cells and cell casts. Mean±SD.n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;△P ＜0.05 vs C;●P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.圖2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學改變及病理評分分析

4 TUNEL 法標記的凋亡細胞水平

在顯微鏡下，細胞核呈棕黃色者為陽性細胞。N 組內(nèi)僅見個別陽性細胞核;DM 組較N 組凋亡明顯增加;與N 組和DM 組比較，DM+CM 組可見大量棕黃色凋亡細胞核;阿托伐他汀能明顯抑制小管上皮細胞凋亡，不同濃度的阿托伐他汀干預后凋亡細胞明顯減少，中濃度阿托伐他汀組的晚期凋亡細胞較DM+CM 組明顯減少，高濃度阿托伐他汀組中僅見少數(shù)凋亡細胞，見圖3。

Figure 3. Analysis of TUNEL-positive apoptotic tubular epithelial cells in each group (×400). A:N;B:DM;C:DM +CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. Mean±SD. n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;○P ＜0.05 vs C;●P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.圖3 TUNEL 法檢測各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況

5 免疫組織化學檢測Bax 和Bcl-2 蛋白表達

圖4、5 顯示，Bax 和Bcl-2 陽性表達分別為棕黃色，Bax 和Bcl-2 在腎小管上皮細胞的胞質和胞膜均有表達。N 組和DM 組Bcl-2 和Bax 表達均較低，DM組Bax 蛋白表達較N 組高，而Bcl-2 蛋白較N 組低;DM+CM 組Bax 蛋白表達與對照組比較顯著增高，而Bcl-2 表達與對照組比較顯著降低(P ＜0.05);與DM+CM 組比較，Bcl-2 隨著阿托伐他汀劑量的升高表達增高(P ＜0.05)，而Bax 隨阿托伐他汀劑量的升高表達降低(P ＜0.05)，高濃度阿托伐他汀組較低劑量及中劑量阿托伐他汀組Bcl-2 表達明顯升高(P＜0.05)，而Bax 表達明顯降低(P ＜0.05)。

Figure 4. Expression of Bax protein in each group (immunohistochemical staining，×200). A:N;B:DM;C:DM + CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. Mean±SD. n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;△P ＜0.05 vs C;▲P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.圖4 免疫組化檢測各組大鼠腎臟Bax 蛋白表達

6 Western blotting 法檢測Bax 和Bcl-2 蛋白表達

如圖6 所示，DM 組與N 組比較，Bcl-2 蛋白表達明顯減少，Bax 蛋白表達明顯增多;與N 組和DM 組比較，CM+DM 組Bcl-2 蛋白表達下調，Bax 蛋白表達上調;與CM+DM 組比較，3 種劑量阿托伐他汀組Bcl-2 蛋白表達上調，Bax 蛋白表達下調。而對于Bcl-2/Bax 比值，DM 組Bcl-2/Bax 比值明顯高于N 組(P ＜0.05);DM + CM 組Bcl-2/Bax 比值較N 組和DM 組明顯下降(P ＜0.05);與DM+CM 組比較，中劑量和大劑量阿托伐他汀組Bcl-2/Bax 比值升高，而小劑量阿托伐他汀組無顯著差異(P ＞0.05)。

Figure 5. Expression of Bcl-2 protein in in each group (immunocytochemical staining，×200). A:N;B:DM;C:DM +CM;D:ATO1;E:ATO2;F:ATO3. Mean±SD. n=4. * P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs B;△P ＜0.05 vs C;▲P ＜0.05 vs D;◆P ＜0.05 vs E.圖5 免疫組化檢測各組大鼠腎臟Bcl-2 蛋白表達

Figure 6. Western blotting analysis of Bcl-2 and Bax protein expression in each group. Mean±SD.n=4. * P ＜0.05 vs N;#P ＜0.05 vs DM;△P ＜0.05 vs DM+CM;▲P ＜0.05 vs ATO1;◆P ＜0.05 vs ATO2.圖6 Western blotting 法檢測各組Bax 和Bcl-2 蛋白的表達

討 論

目前CI-AKI 的發(fā)病機制尚未明確，有研究表明造影劑引起的缺血缺氧是CI-AKI 最主要機制之一。在含碘造影劑進入腎血管后，腎血管血流動力學效應呈雙時相，首先是腎臟血管短暫性舒張和腎血流量增加階段，約持續(xù)20 min 后，腎血管進入強烈痙攣性收縮階段，此過程可持續(xù)4 h 或者更久，引起超過50%的腎血流量急劇減少，從而造成髓質缺血缺氧性損傷［5］。而作為CI-AKI 獨立危險因素之一的糖尿病可以加劇血管收縮，進一步加重造影劑引起的髓質局部灌注不足［3］。

CI-AKI 的缺血缺氧性損傷病理表現(xiàn)為髓質區(qū)域的腎小管上皮細胞凋亡、壞死及小管塌陷，腎小管上皮細胞的線粒體腫脹，而體外條件下的腎小管細胞株，在加入對比劑后也可見明顯的線粒體酶活性及線粒體膜電位的改變［6］。Zager 等［7］的研究表明，含碘造影劑可以引起腎小管細胞的線粒體損傷。而在線粒體損傷后，線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeabilty transition pore，MPTP)開放，使線粒體膜間隙內(nèi)的細胞色素C 大量釋放至胞質中，最終誘導依賴及非依賴性天冬肽酶途徑激活的細胞凋亡［8］。線粒體外膜上的Bcl-2 家族蛋白，尤其是抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 在MPTP 開放和關閉過程中起到關鍵的調控作用;Lee 等［9］對糖尿病模型大鼠注射對比劑后，發(fā)現(xiàn)在髓攀升支粗段組織檢測到了凋亡標志性DNA 片段，最終腎小管上皮細胞出現(xiàn)程序性死亡。Yano 等［11］進一步研究發(fā)現(xiàn)，造影劑上調促凋亡基因bax mRNA 的表達，并下調抑凋亡基因bcl-2 mRNA 表達，導致細胞的凋亡。此外，金可可等［11］發(fā)現(xiàn)，STZ 誘導的糖尿病大鼠可能通過誘導腎小管上皮細胞Bax 蛋白和抑制Bcl-2 蛋白表達，促進腎小管上皮細胞的凋亡。本研究通過凋亡相關蛋白Bcl-2 和Bax 檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，糖尿病較對照組腎小管細胞凋亡增加，且Bcl-2/Bax 比值降低;而對比劑不僅促進腎小管上皮細胞的凋亡，而且使Bcl-2 表達減少，Bax 表達增強，從而證實CI-AKI的發(fā)病可能與糖尿病大鼠腎小管上皮細胞凋亡增加有關，其機制可能與對比劑以及糖尿病干擾Bcl-2蛋白和Bax 蛋白表達作用有關。

目前，對凋亡研究的注意力集中在凋亡更早的過程，即一系列細胞內(nèi)具有關鍵作用的蛋白質參與過程，Bcl-2 和Bax 涉及這一過程。在凋亡及其調控機制研究中，最主要的機制是Bcl-2 家族成員的參與。CI-AKI 屬于一過性的早期病理損傷性疾病，因此在損傷早期進行相應治療顯得尤為重要。CI-AKI的預防藥物的效果仍存在爭議，而基于他汀具有廣泛的心血管保護作用，包括改善血管內(nèi)皮功能、增加內(nèi)皮源性一氧化氮的生物利用度、抗氧化、抗炎癥等作用，他汀對CI-AKI 的預防作用受到極大關注及重視［12-14］。盡管有研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可誘導平滑肌細胞、橫紋肌細胞凋亡［15-16］。但是有研究［17］提出阿托伐他汀可以減少腎小管上皮細胞的凋亡，從而改善輸尿管梗阻引起的腎功能損害;Haylor 等［18］也證實，阿托伐他汀可通過抑制腎小管上皮細胞caspase-3 活化，發(fā)揮抗凋亡作用，進而改善腎臟缺血再灌注損傷。這可能與阿托伐他汀的抗凋亡作用對不同細胞有選擇性。

本研究表明，阿托伐他汀可以上調Bcl-2 蛋白和下調Bax 蛋白表達水平，降低含碘造影劑誘導的腎小管上皮細胞的凋亡率，并改善造影劑引起的腎功能的急性損害。這些結果提示他汀類藥物抑制對比劑誘導的腎小管上皮細胞凋亡的效應，可能與上調Bcl-2 蛋白和下調Bax 蛋白表達水平有關，從而發(fā)揮其腎臟保護作用。這一結論不僅與國內(nèi)外研究報道一致，而且表明了他汀類藥物除抗炎、抗氧化應激和改善血管內(nèi)皮功能等作用外，還有抑制對比劑誘導的腎小管上皮細胞凋亡的作用。同時我們還發(fā)現(xiàn)，與5 mg·kg-1·d-1以及10 mg·kg-1·d-1的阿托伐他汀治療組比較，30 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀可明顯降低對比劑誘導的腎小管上皮細胞凋亡率，大鼠的腎功能以及Bcl-2/Bax 比值均有顯著改善。這提示在接受造影劑的介入治療或影像學檢查之前，負荷劑量他汀類藥物的強化治療可以使易患CI-AKI 的糖尿病高危人群的獲益最大。這一結論為我們在他汀類藥物早期、短程、強化治療預防CI-AKI提供了有力證據(jù)。

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