超聲微泡靶向遞送aFGF 對糖尿病心肌病的治療作用及其機(jī)制研究*

田新橋， 茹 翱， 趙應(yīng)征， 李劍敏， 鄭 磊， 金可可， 張 超

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，浙江 溫州325027;2 溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州325035;3溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州325027)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病(diabetes milletus，DM)引起的一系列心肌代謝和結(jié)構(gòu)異常的病理改變，為糖尿病的常見慢性并發(fā)癥之一。流行病學(xué)資料顯示，DCM 患者日益增多，已成為DM 患者易發(fā)心衰和死亡的主要原因［1］，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。然而，目前臨床上尚缺乏對DCM 的有效治療方法。研究證實(shí)，心肌微血管病變、心肌間質(zhì)纖維化及細(xì)胞凋亡為DCM 的特征性改變，因此，促微血管新生，減輕心肌間質(zhì)纖維化及抗心肌細(xì)胞凋亡可能成為治療DCM 的策略之一。酸性成纖維細(xì)胞生長因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)最初由Thomas 于1984 年從牛腦中分離純化得到，具有誘導(dǎo)血管新生、促進(jìn)膠原水解、抗氧化損傷及神經(jīng)營養(yǎng)保護(hù)等多種生物學(xué)作用［2-3］。因此，aFGF 對DCM 防治應(yīng)具有較大潛力。然而，由于aFGF 在體外極易被氧化失活，且缺乏高效安全的心肌靶向遞送載體，故aFGF 目前在臨床上僅局限于外用治療燒傷、創(chuàng)傷、皮膚潰瘍及皮膚護(hù)理等方面，其在體研究仍處于初步研究階段，且多集中于缺血性心臟病動物實(shí)驗(yàn)，如學(xué)者Geist 等［3］在新西蘭兔缺血心肌梗死區(qū)注射aFGF，1 周后觀察證實(shí)aFGF 可以增加缺血梗死區(qū)心肌血流量及微血管密度。迄今鮮見aFGF 用于治療DCM 的報(bào)道。

近年來，以超聲微泡作為藥物/基因遞送載體進(jìn)行疾病靶向治療的報(bào)道日益增多，超聲微泡目前已成為又一種新的藥物轉(zhuǎn)載系統(tǒng)。本研究選用SonoVue 超聲微泡作為aFGF 的遞送載體并結(jié)合超聲靶向微泡擊破技術(shù)(ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)對DCM 大鼠進(jìn)行干預(yù)，旨在觀察該方法對DCM 大鼠左心室舒縮功能的保護(hù)作用并初步探討其可能機(jī)制，為DCM 的防治研究提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物

健康雄性SPF 級Sprague-Dawley 大鼠40 只，鼠齡40 ～50 d，體質(zhì)量170 ～230 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心代購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物使用許可證號為SYXK(浙)2010-0150。

2 主要試劑

aFGF 干粉由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供(廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心研制，200 μg≈1 800 U);SonoVue 超聲微泡造影劑由Bracco 生產(chǎn)，微囊為磷脂成分，內(nèi)包裹六氟化硫氣體，90%微泡直徑＜6 μm，平均直徑約2. 5 μm;鏈脲佐菌素購自BBI，上海生工生物有限公司分裝，注射前用0. 1 mol/L、pH 值4.0 ～4.4 的檸檬酸緩沖液配制;兔抗鼠CD31 Ⅰ抗購自上海生工生物有限公司;改良Masson 三色染色液購自武漢谷歌生物科技有限公司;TUNEL 染色試劑盒為In situ Apoptosis Detection Kit (DMK500)，購自TaKaRa。實(shí)驗(yàn)儀器為Siemens公司Acuson Sequoia 512C 彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)，15L8w-S 線陣探頭，探頭頻率為12 ～14 MHz;動物呼吸機(jī)型號為HX-300，購自成都泰盟科技有限公司。

3 主要方法

3.1 動物造模及分組 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)挑選28 只腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液70 mg/kg 體質(zhì)量，注射后第1 天、第3 天及第7 天取尾靜脈血測定血糖濃度，血糖值＞16.7 mmol/L 且尿量和飲水量明顯增多者繼續(xù)飼養(yǎng)至第8 周，進(jìn)行超聲心動圖檢測，出現(xiàn)心功能異常者納入DCM 模型組(24 只大鼠成模;4 只未成模而剔除)。其余12 只作為正常對照組，腹腔內(nèi)注射等量檸檬酸緩沖液。

3.2 攜載aFGF 微泡造影劑( SonoVue-aFGF) 制備

臨用前將7 mg aFGF 凍干粉與5 mL 生理鹽水混合，輕度振搖充分溶解后形成aFGF 溶液，再加入到SonoVue 瓶中，于室溫下靜置10 ～20 min 進(jìn)行孵育，期間輕柔振蕩數(shù)次，形成SonoVue-aFGF 溶液。

3.3 實(shí)驗(yàn)處理 24 只DCM 大鼠隨機(jī)平均分成DCM 組和aFGF 治療組。aFGF 治療組大鼠充分麻醉后，將探頭置于大鼠心前區(qū)，取乳頭肌水平左室短軸觀，聚焦深度3.5 ～4.0 cm，經(jīng)尾靜脈注射攜aFGF微泡造影劑0.1 mL，當(dāng)心肌內(nèi)見大量微泡充盈時即用機(jī)器自帶MBD 功能反復(fù)多次擊破微泡(機(jī)械指數(shù)MI=1.9)，直至微泡完全消失，見圖1。正常對照組與DCM 組不做任何處理。于第2 天重復(fù)上述給藥處理1 次。隨后所有大鼠再飼養(yǎng)4 周(飼養(yǎng)過程中DCM 組死亡2 只)。干預(yù)后4 周，所有實(shí)驗(yàn)大鼠充分麻醉，切開大鼠頸前區(qū)皮膚，分離氣管，接動物呼吸機(jī)，打開大鼠胸腔，將心導(dǎo)管從心尖直接刺入大鼠左心室內(nèi)，Chart 5 for Windows 軟件同步記錄左室收縮末壓力(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左室舒張末壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)和左室內(nèi)壓最大上升及下降速率(maximal increase/decrease rate of left ventricular pressure，LV ± dp/dtmax)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時處死大鼠，取心臟，行CD31 免疫組織化學(xué)染色、改良型Masson 膠原染色和TUNEL 染色。

Figure 1. The process of ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD).A:the left ventricular myocardium was filled with contrast agents;B:targeted break;C:the microbubbles were cracked by UTMD.圖1 超聲靶向微泡擊破過程

3.4 CD31 免疫組織化學(xué)染色 采用Polymer 法對心肌組織石蠟切片進(jìn)行CD31 免疫組化染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。封片后在顯微鏡下觀察，微血管被染成棕褐色。每組取12 張切片，每張切片隨機(jī)取20 個400 倍視野計(jì)算微血管數(shù)量，取其均值，作為心肌組織微血管密度(microvessel density，MVD;個/高倍視野)。

3.5 改良型Masson 膠原染色及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)( collagen volume fraction，CVF) 測量 心肌組織石蠟切片脫水后嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。封片后在顯微鏡下觀察，膠原纖維呈藍(lán)色，心肌纖維及紅細(xì)胞呈紅色。隨后應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析測量心肌CVF:每組取12 張切片，每張切片隨機(jī)取20 個200 倍視野，CVF(%)=膠原面積/總面積×100%，取其均值。

3.6 TUNEL 法檢測心肌組織細(xì)胞凋亡指數(shù)( apoptotic index，AI) 心肌組織石蠟切片脫水后嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判斷:陽性細(xì)胞核呈棕色，陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色，紅細(xì)胞呈透明無核黃色。每組取12 張切片，每張切片隨機(jī)取20 個400 倍視野，計(jì)數(shù)該視野細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞數(shù)，AI(%)=視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)×100%。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，若有差別，用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠左心室血流動力學(xué)指標(biāo)的改變

干預(yù)后4 周，DCM 組大鼠LVESP 和LV ± dp/dtmax與正常對照組相比分別減低29%、31%和32%(P ＜0.01)，LVEDP 則較正常對照組增高37%(P ＜0.01)，說明DCM 組大鼠左心室舒縮功能已經(jīng)出現(xiàn)明顯損害;而aFGF 治療組大鼠LVESP 和LV ±dp/dtmax與DCM 組相比分別增高20%、35% 和29%(P ＜0.01)，LVEDP 較DCM 組 減 低18% (P ＜0.01)，表明超聲微泡靶向遞送aFGF 后，大鼠左心室舒縮功能有所好轉(zhuǎn)，aFGF 干預(yù)可以有效改善DCM大鼠的左心室舒縮功能，見表1。

表1 左心室血流動力學(xué)指標(biāo)的改變Table 1. Changes of left ventricular hemodynamic parameters(Mean±SD)

2 各組大鼠心肌MVD 改變

干預(yù)4 周后，CD31 免疫組織化學(xué)染色顯示，正常對照組大鼠心肌內(nèi)有較多微血管且排列整齊;DCM 組大鼠心肌內(nèi)微血管明顯減少、稀疏;aFGF 治療組大鼠心肌內(nèi)微血管數(shù)量較DCM 組大鼠明顯增多。DCM 組大鼠MVD 比正常對照組低58%(P ＜0.01)，aFGF 治療組大鼠則較DCM 對照組增加64%(P ＜0.01)，表明超聲微泡靶向遞送aFGF 后明顯增加DCM 大鼠心肌微血管，見圖2、表2。

Figure 2. The expresults of CD31 in rat myocardium in the three groups examined by immunohistochemical staining (×400).A:control group;B:DCM group;C:aFGF treatment group.圖2 免疫組化染色檢測3 組大鼠心肌組織CD31 表達(dá)

表2 心肌微血管密度、膠原容積分?jǐn)?shù)及凋亡指數(shù)Table 2. Results of microvessel density (MVD)，collagen volume fraction (CVF)and apoptotic index (AI)in rat myocardium(Mean±SD)

3 各組大鼠心肌CVF 改變

干預(yù)后4 周，改良型Masson 膠原染色觀察顯示，正常組大鼠心肌內(nèi)膠原含量較少，主要以心肌纖維、纖維素等為主;DCM 組大鼠心肌內(nèi)膠原大量增生，幾乎充滿整個視野區(qū);而aFGF 治療組大鼠心肌內(nèi)膠原含量明顯減少。DCM 組大鼠CVF 比正常對照組增高67%(P ＜0.01)，aFGF 治療組大鼠則較DCM 對照組減低24%(P ＜0.01)，表明超聲微泡靶向遞送aFGF后明顯降低DCM 大鼠心肌膠原含量，見圖3、表2。

Figure 3. The expression of collagen in rat myocardium in the three groups detected by improved Masson staining (×200).A:control group;B:DCM group:C:aFGF treatment group.圖3 3 組大鼠心肌膠原染色結(jié)果

4 各組大鼠心肌組織AI 改變

干預(yù)后4 周，TUNEL 法染色結(jié)果顯示，正常組大鼠心肌內(nèi)僅有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而DCM 大鼠心肌內(nèi)出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，aFGF 治療組大鼠心肌細(xì)胞凋亡則明顯減少。DCM 組大鼠AI 比正常對照組增高291%(P ＜0.01)，aFGF 治療組大鼠則較DCM 對照組減低49%(P ＜0.01)，表明超聲微泡靶向遞送aFGF 后具有明顯抗DCM 心肌細(xì)胞凋亡的作用，見圖4、表2。

Figure 4. Apoptosis of myocardial cells of rats in the three groups staining detected by TUNEL (×400). A:control group;B:DCM group;C:aFGF treatment group.圖4 TUNEL 法3 組大鼠檢測心肌細(xì)胞凋亡

討 論

aFGF 是成纖維細(xì)胞生長因子家族成員之一，在促進(jìn)細(xì)胞生長、組織形成、誘導(dǎo)血管新生等方面具有重要的作用。aFGF 對缺血心肌的促微血管再生作用由Banai 等于1991 年首先開始研究，已經(jīng)證實(shí)aFGF 具有促進(jìn)心肌微血管新生、降解心肌膠原、擴(kuò)張血管、缺血保護(hù)、神經(jīng)營養(yǎng)等生物學(xué)效應(yīng)［4］。此外，李彥等［5-6］與Palmen 等［7］的研究均發(fā)現(xiàn)，aFGF 還具有顯著降低缺血心肌細(xì)胞凋亡率，提高心肌抗氧化的能力。DCM 是指糖尿病導(dǎo)致的特異性心肌病變，其確切發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明了。已有的研究表明，DCM 的始動因素為心肌能量代謝異常、氧化應(yīng)激、心肌微血管病變、心肌間質(zhì)纖維化等多因素共同促進(jìn)DCM 的病理發(fā)展。其中微血管病變與心肌間質(zhì)纖維化為DCM 的特征性改變，氧化應(yīng)激在DCM的病程演進(jìn)中扮演著重要的角色。氧化應(yīng)激一方面可損傷DNA 和線粒體膜，釋放線粒體中的凋亡活性物質(zhì)，啟動細(xì)胞凋亡程序，增加心肌組織細(xì)胞凋亡率［8-9］;另一方面促進(jìn)晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)的增多。AGEs 增多可破壞心肌膠原生成與降解之間的平衡，導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化，加重心肌僵硬度，影響心肌舒縮功能［10］，同時，AGEs 增多聚集可使心肌微血管基底膜增厚、管腔橫截面積減小、微血管密度減低，導(dǎo)致心肌微循環(huán)障礙、心肌細(xì)胞缺血損傷和壞死。因此，aFGF 對于DCM 的治療應(yīng)該具有重要的價值。然而，由于缺乏合適的遞送載體，目前aFGF 的體內(nèi)應(yīng)用仍局限于采用直接心肌、靜脈或腹腔注射方式的動物實(shí)驗(yàn)研究，迄今尚無aFGF 用于治療糖尿病心肌病的報(bào)道。實(shí)現(xiàn)aFGF 的靶向遞送使其發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，關(guān)鍵在于構(gòu)建一種高效、安全的遞送載體。

近年來大量研究表明，超聲微泡可以攜帶各種藥物/基因，利用微泡被超聲能量靶向擊破時產(chǎn)生的空化效應(yīng)和聲孔效應(yīng)，遞送藥物/基因進(jìn)入靶細(xì)胞或靶組織，達(dá)到治療目的［11-12］，與質(zhì)粒和腺病毒載體相比，既提高了遞送效率，又不會產(chǎn)生以腺病毒為載體時引起的免疫反應(yīng)。國內(nèi)王瀟等［13］已應(yīng)用SonoVue劑介導(dǎo)Ang-1 基因靶向治療心肌梗死，證實(shí)該方法可有效改善心肌梗死動物左室心肌功能。因此以超聲微泡作為aFGF 的心肌靶向遞送載體，克服了aFGF直接心肌注射存在有創(chuàng)性和操作復(fù)雜性等問題，同時實(shí)現(xiàn)aFGF 的靶向、高效、安全遞送。目前Zhao等［14］已經(jīng)應(yīng)用攜載aFGF 的微泡治療心肌梗死，證實(shí)攜載aFGF 的微泡可有效改善心肌梗死動物的心功能。

本研究構(gòu)建攜載aFGF 的SonoVue 微泡，以超聲靶向微泡擊破技術(shù)作為遞送手段，利用超聲能量使微泡在心肌組織靶向破裂，從而將aFGF 定向釋放并發(fā)揮作用，干預(yù)后4 周應(yīng)用心導(dǎo)管檢測心功能變化，觀察發(fā)現(xiàn)aFGF 治療組大鼠左心室各項(xiàng)收縮功能指標(biāo)均較DCM 組明顯改善。CD31 免疫組織化學(xué)染色、改良型Masson 膠原染色及TUNEL 法檢測AI 的結(jié)果亦證實(shí)，aFGF 治療組心肌微血管數(shù)量較DCM組明顯增多，膠原含量較DCM 組明顯減少，細(xì)胞凋亡較DCM 組明顯減輕。分析其原因，微泡被超聲能量靶向擊破時產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以在其周圍形成高能環(huán)境［11］，隨后形成作用于內(nèi)皮細(xì)胞膜與毛細(xì)血管上的沖擊波，沖擊波產(chǎn)生的切應(yīng)力可以使膜上出現(xiàn)暫時性開放小孔即聲孔效應(yīng)［15］，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，使較多的aFGF 通過開放小孔進(jìn)入心肌組織而發(fā)揮其促血管新生、降解膠原及抗氧化的生物學(xué)功能，逐漸改善心肌微循環(huán)，減輕心肌間質(zhì)纖維化，減少細(xì)胞凋亡，改善心功能。

綜上所述，超聲微泡靶向遞送aFGF 至心肌組織，可有效改善DCM 大鼠左室舒縮功能，有望成為今后DCM 治療的新策略，應(yīng)用前景廣闊。本研究存在一些局限性，比如aFGF 是多種類型細(xì)胞的促有絲分裂原，其多效性有可能引起治療目的之外的細(xì)胞和組織生長，從而產(chǎn)生副作用;而且本研究對DCM大鼠治療的療效受超聲能量、造影劑的數(shù)量、微泡自身特性等因素的影響。因此，今后應(yīng)進(jìn)一步深入研究和優(yōu)化該治療方法的載藥微泡濃度、應(yīng)用劑量和時機(jī)以及超聲靶向爆破時機(jī)械指數(shù)等參數(shù)的設(shè)置，以能取得滿意的治療效果。

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