重組人腦鈉肽對兔缺血再灌注后心室肌細(xì)胞L-鈣離子通道電流的影響

丁超，郭潔，王冬梅，李潔，陳會校，孫家安

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）技術(shù)帶來的再灌注損傷，直接影響到患者的預(yù)后，特別是再灌注心律失常，是缺血再灌注期間患者猝死的最主要原因之一[1]。重組人腦鈉肽（rhBNP）能夠拮抗腎素－血管緊張素系統(tǒng)（RAS）和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活，抑制心肌重塑[2,3]。

本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究rhBNP對缺血再灌注后兔心室肌細(xì)胞跨膜L－鈣通道電流（ICa-L）的影響，探討rhBNP拮抗再灌注心律失常的細(xì)胞學(xué)離子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 健康新西蘭大耳白兔45只，雌雄不限，體重（2～2.5）Kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為3組（每組15只）：缺血再灌注組（I-R組），rhBNP治療組（rhBNP組）和假手術(shù)對照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與溶液 實(shí)驗(yàn)藥物：HEPES, EGTA, 4-aminopyridine（4-AP）, 膠原酶Ⅰ，氯化膽堿購自Sigama公司，余試劑均為國產(chǎn)分析純。rhBNP（新活素，0.5mg/支，由成都諾迪康生物制藥有限公司生產(chǎn)）。溶液：ICa-L電極外液：氯化膽堿 120 mmol/L，CsOH 4 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.3。加入4-AP 5 mmol/L、CsCl 20 mmol/L以阻斷鉀電流。ICa-L電極內(nèi)液：CsCl 80 mmol/L，MgCl22 mmol/L，ATPNa2 5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.3。

1.3 心肌缺血再灌注動物模型建立 采用2.5%硫噴妥鈉1.0ml/kg耳緣靜脈麻醉，利用針刺電極插入動物四肢皮下記錄肢導(dǎo)心電圖。剪開心包膜后，在左心耳下2mm，分離左冠狀動脈前降支，用3/8圓2.5×8mm不銹鋼圓針，帶6-0絲線穿過心肌淺層，絲線穿過一塑料管，拉緊塑料管兩端絲線，使塑料管壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，30 min后，放松結(jié)扎線后行心肌再灌注120 min。其中假手術(shù)對照組開胸后僅分離左冠狀動脈前降支并穿線而不結(jié)扎，以排除開胸手術(shù)對心肌細(xì)胞電生理參數(shù)的影響。在缺血再灌注模型開始后，rhBNP組動物耳緣靜脈注射rhBNP 0.06μg/（kg.min）（持續(xù)30 min），I-R組和對照組動物由耳緣靜脈注射相同劑量的生理鹽水。

1.4 心律失常評分標(biāo)準(zhǔn) 采用心電監(jiān)護(hù)儀進(jìn)行監(jiān)測。心律失常診斷標(biāo)準(zhǔn)按照Lambeth會議標(biāo)準(zhǔn)，評分則采用Curtis-Walker評分規(guī)則[4]，對心律失常嚴(yán)重程度進(jìn)行定量分析。具體如下：①0分：無心律失常；②1分：偶發(fā)性室性早搏（指1min內(nèi)發(fā)生3次以下的室性早搏）；③2分：頻發(fā)性室性早搏（指1min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室性早搏）；④3分：偶發(fā)性室速（指1min內(nèi)發(fā)生3次以下的室速）；⑤4分：頻發(fā)性室速（指1min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室速）或偶發(fā)性室顫（指1min內(nèi)發(fā)生3次以下的室顫）；⑥5分：頻發(fā)性室顫（指1min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室顫）或死亡。

1.5 細(xì)胞分離 采用酶解（膠原酶I 0.4mg/ml，Sigma公司）的方法分離單個(gè)心室肌細(xì)胞[5]。細(xì)胞來源于心臟冠狀動脈左前降支毗鄰的左心室前壁梗死區(qū)部位，特征為此梗死區(qū)外膜變?yōu)榘咨咂瑺?；對照組細(xì)胞則取自左心室前壁與梗死區(qū)相對應(yīng)的部位。

1.6 膜片鉗全細(xì)胞記錄 按Hamill法[6]進(jìn)行，脈沖信號由pulse+pulsefit軟件（HEKA，version 8.53）控制，通道信號經(jīng)EPC-9膜片鉗放大器（HEKA，德國）放大，通過Ag-AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生的電流信號經(jīng)EPC-9轉(zhuǎn)換，為pulse+pulsefit軟件收集、分析。各電流幅值除以細(xì)胞膜電容所得即為電流密度，以不同鉗制電壓下的電流密度繪成電流—電壓關(guān)系（I-V）曲線。所有實(shí)驗(yàn)在室溫（25℃）下進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 rhBNP對缺血再灌注中心律失常的影響 對照組僅出現(xiàn)偶發(fā)室性早搏，I-R組室速和室顫發(fā)生率明顯增加，心律失常評分明顯增加（P＜0.01）；與I-R組相比，rhBNP組室速和室顫發(fā)生率下降，心律失常評分降低（P ＜0.05）。

2.2 rhBNP對缺血再灌注后心肌細(xì)胞ICa-L的影響 從維持電位（Holding potential，HP）-50 mV開始，階躍+10 mV，逐步去極化到+40 mV，時(shí)程250 ms。以不同鉗制電壓下的ICa-L電流強(qiáng)度繪成I-V曲線。均在-40 mV激活，0 mV達(dá)峰值，+50 mV時(shí)反轉(zhuǎn)。I-R組與對照組相比，I-V曲線上移；rhBNP組與I-R組相比，I-V曲線下移，接近對照組。但I(xiàn)Ca-L電壓依賴性不變，對激活電位、峰值電位、反轉(zhuǎn)電位及I-V曲線的形態(tài)軌跡均無影響（圖1）。

表1 三組心律失常的發(fā)生情況及心律失常評分

圖1 rhBNP對缺血心肌細(xì)胞ICa-LI-V曲線的影響

3 討論

再灌注心律失常是指缺血心肌的部分或全部在血流灌注恢復(fù)的過程中所發(fā)生的心律失常，進(jìn)而導(dǎo)致患者血液動力學(xué)改變，是缺血再灌注期患者猝死的重要原因之一，約占80%[1]?？剐穆墒СＫ幬飩鹘y(tǒng)作用靶點(diǎn)是直接阻斷某一離子通道，但這些藥物對病變心臟的室性快速心律失常的療效不佳且有負(fù)性效應(yīng)，特別是心律失常抑制試驗(yàn)（CAST）中，應(yīng)用鈉通道阻斷劑氟卡胺及恩卡胺治療急性心肌梗死（AMI）后室性心律失常，增加了死亡率，引發(fā)了對傳統(tǒng)抗心律失常藥物致心律失常副作用的擔(dān)憂。

腦鈉肽（BNP）是一種主要由心室肌分泌的激素，國外基礎(chǔ)及臨床研究結(jié)果表明，BNP可擴(kuò)張機(jī)體動靜脈血管，降低肺及外周血管阻力，提高心輸出量，降低容量負(fù)荷，并可拮抗繼發(fā)性的RAS系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活[2,7]，對抗毒性作用，減少心肌梗死面積[8]，改善患者的臨床和血液動力學(xué)指標(biāo)[9]。rhBNP是一種應(yīng)用生物重組技術(shù)生產(chǎn)的、與人類內(nèi)源性BNP等同的肽類物質(zhì)，已在2001年被美國食品及藥品管理署（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療急性失代償性心衰。

再灌注心律失常的發(fā)生機(jī)理尚不完全明確，鈣超載可能是原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，rhBNP可降低心肌缺血再灌注期間心律失常的發(fā)生率。心肌缺血再灌注后，ICa-L明顯增高，rhBNP可使上升的ICa-L下調(diào)，逆轉(zhuǎn)電重構(gòu)，可能為rhBNP降低心律失常發(fā)生率的細(xì)胞學(xué)離子機(jī)制。rhBNP可能通過兩條途徑發(fā)揮抗心律失常作用：一方面通過鈣拮抗作用，提高室顫閾，增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；另一方面通過拮抗RAS系統(tǒng)和內(nèi)皮素活性、抑制交感神經(jīng)興奮性，改善血液動力學(xué)指標(biāo)，修復(fù)心室肌細(xì)胞離子通道的損傷而發(fā)揮抗心律失常作用。心肌細(xì)胞膜上的離子通道本來是有序的，病變心肌多離子通道的改變使動作電位縮短或延長，導(dǎo)致心律失常。由于動作電位的長度與膜復(fù)極化過程總的離子流相關(guān)，單純阻斷某一離子通道的藥物難以發(fā)揮理想的作用。所以，有效的抗心律失常藥物的新靶點(diǎn)應(yīng)以降低離子通道的損傷為楔入點(diǎn)，改變離子通道的環(huán)境尤為重要。

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