蛋白質(zhì)組學技術(shù)在乳品研究中的應用

蘆 晶， 劉 鷺， 張書文， 呂加平

中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 北京 100193

牛乳已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪蝎@取營養(yǎng)的主要食品之一。牛乳中蛋白質(zhì)含量為3%～4%，脂肪含量為3%～5%，乳糖含量為5% 左右，并含有豐富的礦物質(zhì)及維生素。牛乳蛋白質(zhì)主要分為三類：酪蛋白、乳清蛋白及乳脂肪球膜蛋白。 其中，酪蛋白約占乳總蛋白質(zhì)含量的80%，乳清蛋白占18%～19%，乳脂肪球膜蛋白只占1%～2%。通過傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)化學手段研究發(fā)現(xiàn)，牛乳酪蛋白主要含有αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白；乳清蛋白主要含有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白及免疫球蛋白;乳脂肪球膜蛋白主要包括黃嘌呤氧化酶、嗜乳脂蛋白、脂肪分化相關(guān)蛋白和PAS 6/7[1]。由于技術(shù)水平的限制，利用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學手段從乳品中鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)量有限，限制了對乳品蛋白質(zhì)營養(yǎng)和功能活性的利用。近年來,隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展，通過該技術(shù)已發(fā)現(xiàn)牛乳中含有多達上百種蛋白質(zhì)，包括大量免疫蛋白、乳品成分合成相關(guān)的酶類及轉(zhuǎn)運蛋白、細胞形態(tài)相關(guān)蛋白質(zhì)等。對蛋白質(zhì)種類的鑒定及功能性質(zhì)的研究將有助于提高對牛乳的認識和利用。

1 蛋白質(zhì)組學技術(shù)

在過去幾十年中，蛋白質(zhì)組學技術(shù)從出現(xiàn)到發(fā)展取得了巨大的進步。蛋白質(zhì)組學技術(shù)可以定性、定量分析不同樣品中的蛋白質(zhì)種類及性質(zhì)[2]。蛋白質(zhì)組學技術(shù)一般包含樣品處理、質(zhì)譜測定和數(shù)據(jù)分析三個步驟。

1.1 樣品處理

樣品處理包括從不同的樣品中提取蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)前處理和蛋白質(zhì)的酶解。根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的性質(zhì)，也可以減少或省略樣品處理中蛋白質(zhì)提取及前處理步驟。 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳和一維聚丙烯酰胺凝膠電泳是常用的蛋白質(zhì)前處理方法。二維聚丙烯酰胺凝膠電泳是先根據(jù)蛋白質(zhì)等電點將蛋白質(zhì)分離，然后根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進行二次分離，進而選取電泳膠片上的蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析。一維聚丙烯酰胺凝膠電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量將蛋白質(zhì)進行分離，將電泳膠條的目標膠條酶解后進行質(zhì)譜分析，或?qū)⒛z條平均切割成幾段，將不同條段進行酶解及質(zhì)譜分析。如果樣品中蛋白質(zhì)種類不復雜，也可將蛋白質(zhì)直接進行酶解測定。

通過二維聚丙烯酰胺凝膠電泳和一維聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質(zhì)前處理較為常見，但兩者均具有局限性。經(jīng)過二維聚丙烯酰胺凝膠電泳處理后的蛋白質(zhì)樣品在質(zhì)譜分析中鑒定出的蛋白質(zhì)種類較少，因為只有被染色的蛋白質(zhì)可以進行質(zhì)譜分析，許多含量較低的蛋白質(zhì)在染色過程中被含量較高的蛋白質(zhì)所覆蓋未被檢出，而低含量的蛋白質(zhì)往往具有重要的生理生化作用[3～5]。另外，二維凝膠電泳很難將疏水性強的膜蛋白進行分離[6]，而對于膜蛋白的研究在生物學領(lǐng)域具有重要的意義。通過一維聚丙烯酰胺凝膠電泳測定出的蛋白質(zhì)種類及數(shù)量較大，但是由于對凝膠條帶的切割，大大增加了實驗過程中的步驟和工作量。一維聚丙烯酰胺凝膠電泳不適用于對蛋白質(zhì)進行定量分析[3]。

近幾年，蛋白質(zhì)前處理新技術(shù)不斷出現(xiàn)。如二維液相色譜分離前處理技術(shù)和過濾器輔助樣品前處理技術(shù)。二維液相色譜分離是將酶解蛋白質(zhì)肽段進行二次液相色譜分離，進而達到預期的分離效果，該技術(shù)可以加大蛋白質(zhì)鑒定的種類及數(shù)量[7]。 過濾器輔助樣品前處理技術(shù)是利用SDS將膜蛋白進行溶解，進而通過過濾器將SDS從樣品中移除，解決了凝膠電泳前處理方法對膜蛋白分離的局限性。另外，過濾器輔助樣品前處理方法還減少了一維電泳中過多的操作步驟，大大降低了實驗誤差，可以用于蛋白質(zhì)質(zhì)譜定量分析[8]。

1.2 質(zhì)譜測定

通常情況下，酶解蛋白質(zhì)會先通過液相色譜分離肽段后進行質(zhì)譜測定，確定各肽段的分子量。除了對蛋白質(zhì)種類的鑒定，蛋白質(zhì)的含量也逐漸成為研究的焦點。比起蛋白質(zhì)種類，含量似乎更能解釋生物學差異。因此利用蛋白質(zhì)組學對蛋白質(zhì)含量進行測定逐漸成為蛋白質(zhì)組學研究中的主流。目前對于利用質(zhì)譜技術(shù)對蛋白質(zhì)含量測定主要分為兩大類，一類是絕對蛋白質(zhì)含量的測定，另一類是相對蛋白質(zhì)含量的測定。絕對蛋白質(zhì)含量測定是利用標準蛋白質(zhì)肽段物質(zhì)對特定的肽段進行定量分析，此法適用于針對個別蛋白質(zhì)的定量分析。相對蛋白質(zhì)含量測定是目前蛋白質(zhì)組學中應用較多的方法，分為標記法和非標記法。標記法利用標記物質(zhì)與蛋白質(zhì)特定氨基酸的結(jié)合，利用不同標記物分子量的差異，對不同樣品中的同一種蛋白質(zhì)進行比較分析。 常見的標記物質(zhì)有iTRAQ、SILAC、ICAT 和二甲基標記。非標記法利用質(zhì)譜中蛋白質(zhì)肽段圖譜強度對不同樣品中同一蛋白質(zhì)的含量進行比較，避免了使用昂貴的標記物質(zhì)，但是為得到精確的定量數(shù)據(jù)，實驗往往需要大量的重復[9～11]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析是蛋白質(zhì)組學技術(shù)最重要的步驟。利用生物信息學，運用特定的算法，根據(jù)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)酶解物肽段的分子量與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，從而鑒定出樣品中的蛋白質(zhì)種類。目前用于蛋白質(zhì)組學鑒定的軟件有多種，較常用的有MaxQuant、X!Tadam和Mascot 等。

2 蛋白質(zhì)組學在乳品研究中的應用

近年來,蛋白質(zhì)組學技術(shù)已廣泛應用于乳品中不同蛋白質(zhì)組分的研究，包括酪蛋白、乳清蛋白和乳脂肪球膜蛋白。通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)，乳品中除了熟知的幾種主要蛋白質(zhì)外還含有上百種不同種類的蛋白質(zhì)。 在蛋白質(zhì)組學研究中，也同時討論了這些蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。D′Alessandro等[12]將不同乳品蛋白質(zhì)組學研究整合并進行綜合性生物信息學分析，總結(jié)分析了牛乳中573種蛋白質(zhì)的編碼基因及代謝途徑，這些蛋白質(zhì)涉及牛乳營養(yǎng)物質(zhì)的運輸、機體免疫防御及脂類代謝等功能，還有大量與細胞增殖過程和生理結(jié)構(gòu)、血液系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。對牛乳中蛋白質(zhì)種類的分析，增加了牛乳的利用廣度。

2.1 酪蛋白蛋白質(zhì)組學

酪蛋白蛋白質(zhì)組學研究主要包括酪蛋白種類與異構(gòu)體分析及磷酸化研究幾個方面。2004年，Holland等[13]利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)了10種κ-酪蛋白的異構(gòu)體。Ciavardelli等[14]利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測出牛乳中α-酪蛋白和β-酪蛋白磷酸化位點，使酪蛋白的磷酸化逐漸成為研究酪蛋白蛋白質(zhì)組學的研究重點[15]。

2.2 乳清蛋白質(zhì)組學

乳清蛋白占牛乳蛋白質(zhì)總量的18%～20%，除α-乳白蛋白和β-乳球蛋白外，還含有較大量的免疫球蛋白。近年來，通過蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白中含量最大的蛋白質(zhì)種類為機體防御蛋白質(zhì)，包括含量較高的免疫球蛋白和含量較低的補體系統(tǒng)蛋白等[16]。目前，對于機體防御蛋白的關(guān)注較多，大量的研究希望通過乳清蛋白質(zhì)組學找出預測牛乳房炎的生物標記物。乳房炎是奶牛飼養(yǎng)業(yè)中比較嚴重且常易出現(xiàn)的問題之一，它會直接影響奶牛的牛乳產(chǎn)量和奶牛的繁殖性能。對于臨床型乳房炎的檢測比較容易，因為臨床型乳房炎有非常清楚的發(fā)病跡象。但是對于隱型乳房炎的檢測，目前還沒有特別快捷準確的方法。因此，隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展，人們希望通過對比臨床型乳房炎、隱型乳房炎及健康乳房分泌的乳清蛋白，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)種類及組成的差異，找出可以預測隱型乳房炎的生物標記物。 Boehmer等[17]利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對比了受大腸桿菌侵染的乳房在侵染不同時間后分泌的乳清蛋白組成和含量差異，發(fā)現(xiàn)抗菌肽-1蛋白和肽聚糖識別蛋白受體蛋白的含量隨著侵染時間及體細胞數(shù)的增加而增加。Alonso-Fauste等[18]對比了健康及乳房炎乳清，發(fā)現(xiàn)乳房炎乳中含有大量細胞源蛋白質(zhì)，而健康乳清中沒有此類蛋白或者含量很低，免疫相關(guān)蛋白質(zhì)的含量在健康乳和乳房炎乳中都不同。另外，前列腺素D合成酶也是一種預測乳房炎的生物標記物[19]。

2.3 乳脂肪球膜蛋白質(zhì)組學

近年來，備受關(guān)注的另外一個乳蛋白組分是乳脂肪球膜蛋白。 乳脂肪球在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙層膜中形成并分泌到細胞質(zhì)中，在分泌的過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜會覆蓋在乳脂肪球上。乳脂肪球在細胞質(zhì)中互相融合并移動到頂端質(zhì)膜，通過特殊的類似于發(fā)芽的過程，乳脂肪球分泌到牛乳中，在這個分泌過程中，細胞膜的雙層膜結(jié)構(gòu)會覆蓋在乳脂肪球上。另外，部分細胞質(zhì)中的物質(zhì)也會被包裹在乳脂肪球內(nèi)膜(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外層膜)和外膜(細胞膜)之間。因此，乳脂肪球膜蛋白質(zhì)包含來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜及細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，可以部分代表泌乳細胞中的蛋白質(zhì)[20,21]。由此，近些年來部分研究通過對乳脂肪球膜蛋白質(zhì)組成及種類的分析揭示泌乳機理。 盡管乳脂肪球膜蛋白只占總?cè)榈鞍踪|(zhì)的1%～2%，但是它卻是乳蛋白不同組分中最具有多樣性的蛋白質(zhì)。Lu 等[22]利用過濾器輔助樣品前處理方法結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，在乳脂肪球膜中檢測出169種蛋白質(zhì)，并根據(jù)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)進行了分類，發(fā)現(xiàn)乳脂肪球膜蛋白包括免疫相關(guān)蛋白質(zhì)、信號傳導蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)運輸、脂類代謝和細胞周期附著等生理功能相關(guān)蛋白質(zhì)。在動物生理學對泌乳機理的研究中，常用的研究對象為牛乳房組織，但是提取牛乳房組織是一個復雜的過程，會影響奶牛的后續(xù)泌乳，因此乳脂肪球膜蛋白質(zhì)成為一個簡單易得的替代物。Lu等[23]研究了負能量平衡和正能量平衡奶牛分泌的乳脂肪球膜蛋白的差別，發(fā)現(xiàn)處于負能量平衡的奶牛會分泌急性期蛋白，而正能量平衡的奶牛會分泌較多膽固醇合成蛋白和Stomatin蛋白質(zhì)，初步揭示了能量平衡對泌乳生理過程的影響。Reinhardt等[24]對比了泌乳第7 d和初乳的乳脂肪球膜蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)與泌乳相關(guān)的黃嘌呤氧化酶、嗜乳脂蛋白、脂肪分化相關(guān)蛋白隨著泌乳時間的延長而增加，另外第7 d牛乳中含有較高含量的脂類代謝相關(guān)蛋白質(zhì)，而載脂蛋白A、 CIII、E和A IV的含量在第7 d較低。研究初步揭示了隨著泌乳期增加泌乳細胞中代謝途徑的變化。

3 展望

蛋白質(zhì)組學在蛋白質(zhì)組成、含量及結(jié)構(gòu)研究中起到了重要的作用。牛乳蛋白質(zhì)組學可以幫助理解牛乳的合成與分泌過程，為生產(chǎn)符合需要的乳制品提供理論基礎(chǔ)。同時，還可應用于研究生產(chǎn)加工過程對牛乳蛋白質(zhì)的影響，幫助優(yōu)化牛乳加工技術(shù)。通過對牛乳蛋白質(zhì)組成的深入了解，對充分利用牛乳為人類營養(yǎng)健康做貢獻提供了基礎(chǔ)知識。

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