HPLC-MS/MS法測(cè)定樹莓中樹莓酮含量的研究

李 斌, 王小杰, 楊 磊, 孟憲軍*

1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 沈陽 110866；2.阜新桃李園集團(tuán)公司， 遼寧 阜新 123000

樹莓是一種薔薇科植物，其果實(shí)中含有的主要芳香類化合物為樹莓酮[4-(4-羥基苯基)-2-丁酮,raspberry ketone，RK][1,2]，是一種已廣泛應(yīng)用的具有幽香果香的食用香精[3]，具有影響脂肪代謝從而抗肥胖的作用[4]。樹莓酮是樹莓的特征氣味成分，其閾值為1～10 μg/L[5,6]。樹莓酮屬于甲基酮類化合物，與辣椒素結(jié)構(gòu)相似[7]，目前，對(duì)其生物合成、功能特性及檢測(cè)方法都有廣泛研究[8～10]。樹莓酮的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[11,12]和分光光度法[13]。由于樹莓酮在樹莓中的含量較少，經(jīng)實(shí)際檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這兩種方法在測(cè)定中并不非常適用，因此需要開發(fā)更加靈敏的檢測(cè)方法。本研究建立了液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定方法，靈敏度高，適用于樹莓酮的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹莓果實(shí)，干燥后粉碎，過60目篩備用；天然樹莓酮，純度≥99%，購自武漢合中醫(yī)藥原料有限公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯為色譜純，購自Fisher公司；乙醚、HCl、NaHCO3、NaOH、Na2SO4均為分析純，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)室用水為高純水。

1.2 主要儀器

數(shù)控超聲波清洗器，KQ-100DB型，昆山市超聲波儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水槽，DKB-8A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DHG-9070A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；三重四級(jí)質(zhì)譜儀，API 4000型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；液相色譜儀，LC 20A型，日本島津公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氮吹儀、離心機(jī)等。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)品0. 010 0 g，置于100 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解定容，混勻，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4℃保存。精密量取樹莓酮儲(chǔ)備液1 mL置于100 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成1 000 μg/L中間溶液，-18℃避光保存。

1.3.2樣品前處理 除去樹莓果實(shí)中的雜質(zhì)，勻漿后烘干。準(zhǔn)確稱量樹莓果實(shí)粗粉20.00 g，包入濾紙中放于提取器內(nèi)，60℃下甲醇提取4 h后收集提取液。甲醇提取液在50℃以下真空蒸發(fā)回收溶劑后，甲醇提取物以1.00 g甲醇提取物加100 mL 10%甲醇的比例溶解，再以乙醚萃取3次(液比1∶3)，合并乙醚萃取液，蒸發(fā)溶劑得到紅棕色油狀浸膏1.00 g。

1.3.3樹莓酮的提取 樹莓提取物浸膏用乙醚溶解后，用1%鹽酸提取，所得酸水液經(jīng)堿化后再用乙醚萃取，除去樹莓提取物中堿性成分。將分出堿性成分的乙醚液，再分別用5% NaHCO3和2% NaOH氫氧化鈉萃取，所得水溶液分別酸化后用乙醚萃取，除去提取物中的弱酸性成分和酚性成分。將分出堿性、酸性、酚性成分的樹莓提取物乙醚液用水洗至中性，以無水Na2SO4干燥后，加NaHCO3飽和溶液，分出水層，加堿液處理，以乙醚萃取，得到提取物中的甲基酮成分[14]。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)掉大部分的溶劑，待蒸餾瓶中所剩溶液為2～3 mL時(shí)，將其轉(zhuǎn)移出來，再用溶劑沖洗蒸餾瓶，合并溶液，無水Na2SO4脫水，過濾，自然揮發(fā)掉溶劑，甲醇定容到5 mL，過0.45 μm的微孔濾膜，密封4℃冷藏，備用。

1.3.4HPLC-MS/MS分析條件 液相色譜條件：色譜柱采用Symmetry C18柱(2.0 mm×50 mm，2 μm)。流動(dòng)相A 為水，B為甲醇；0～5 min等度洗脫：50%A/50%B。流速為0.25 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣體積25 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓(IS)5 500 V；霧化氣壓力(GS1)65 Psi；氣簾氣壓力(CUR)10 Psi；輔助氣壓力(GS2)65 Psi； 離子源溫度(TEM)550℃；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量(CE)及去簇電壓(DP)見表1。

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取7份樹莓空白樣品提取液10 mL，加入樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成濃度為1.0、2.0、10.0、20.0、50.0、100.0和500.0 μg/kg系列樣品，以樹莓酮峰面積比值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，以樹莓酮的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，加權(quán)計(jì)算線性回歸方程。以信噪比(S/N)為10進(jìn)行計(jì)算，回歸方程為：

Y=5.68×105X-3.45×104r=0.998 9

表1 樹莓酮的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for the determination of RK.

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

不同流動(dòng)相對(duì)樹莓酮分子質(zhì)子化和色譜分離具有一定程度的影響。常用流動(dòng)相有乙腈-水和甲醇-水。以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，質(zhì)譜的信號(hào)較低，色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；以甲醇-水作為流動(dòng)相，質(zhì)譜的信號(hào)明顯提高，峰形對(duì)稱。因此本研究選擇甲醇-水作為流動(dòng)相。

為了保證HPLC色譜分析時(shí)抑制樣品的電離，改善峰形，在流動(dòng)相甲醇-水中添加不同量的甲酸(0、0.1%、0.3%)，并比較了其對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響，結(jié)果顯示，添加0.1%甲酸時(shí)質(zhì)譜信號(hào)最高，隨著甲酸添加量加大信號(hào)反而降低。推斷少量氫離子對(duì)樹莓酮質(zhì)子化具有促進(jìn)作用，但氫離子的濃度過大則表現(xiàn)為抑制作用。所以本實(shí)驗(yàn)選擇添加0.1%甲酸的甲醇-水作為流動(dòng)相。

在優(yōu)化的色譜條件下，樹莓酮可以得到良好的分離，其保留時(shí)間大約為2 min，峰形對(duì)稱，無雜峰干擾，見圖1。

圖1 樹莓酮的提取離子色譜圖Fig.1 XIC of raspberry ketone.a.樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)品；b.樣品

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在流動(dòng)注射狀態(tài)下，將1 mg/L樹莓酮甲醇溶液在正離子和負(fù)離子掃描模式下進(jìn)行全掃描(+Q1掃描)以選擇分子離子峰和電離方式。結(jié)果表明，正離子模式下[M+H]+為最強(qiáng)峰m/z 164.8，選擇其作為母離子。在二級(jí)質(zhì)譜掃描，通過調(diào)節(jié)碰撞能(CE)和去簇電壓(DP)，選擇豐度最高，干擾較小的子離子為定量離子m/z 106.7，豐度次之為定性離子m/z 77.0。樹莓酮的質(zhì)譜裂解方式見圖2。

圖2 樹莓酮的二級(jí)質(zhì)譜掃描圖Fig.2 Second order scanning mass spectrogram of raspberry ketone.

2.3 檢測(cè)定量限及線性范圍

不同基質(zhì)中樹莓酮的定量檢測(cè)限為1.0 μg/kg,在1～500.0 μg/kg范圍具有良好線性關(guān)系。

2.4 回收率、精密度

分別稱取的空白樣品20.00 g，添加適量的樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度為1.0、2.0和10.0 μg/kg，每個(gè)濃度進(jìn)行6樣本分析，結(jié)果見表2。本方法的回收率為75.4%～82.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.97%～8.40%。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

超市購買10份樹莓樣品，經(jīng)回流提取，串聯(lián)質(zhì)譜定量。樹莓酮檢出率100%，樹莓中樹莓酮含量范圍在71.4～240.0 μg/kg。實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果見表3，樹莓中樹莓酮的含量在71.4～240 μg/kg范圍內(nèi)不等。

表2 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experimental results of recovery rate and degree of precision.

表3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 The detection result of actual samples.

3 討論

由于樹莓中樹莓酮含量較低，其檢測(cè)既要求靈敏度高，還要求樣品提取率高。樹莓酮不溶于水和石油英，溶于甲醇、乙醚和揮發(fā)性油等有機(jī)溶液，其中甲醇具有沸點(diǎn)低、對(duì)植物細(xì)胞穿透能力強(qiáng)和價(jià)格低的優(yōu)點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)室常用試劑，它能夠溶出樹莓果實(shí)中除蛋白質(zhì)果膠淀粉部分多糖外的大部分親水性物質(zhì)，而且一些難溶于水的親脂性成分在甲醇中溶解度也比較大，可以被浸提出來，可以保證樹莓果實(shí)中的甲基酮成分盡可能全部浸提出來[15]。因此在選擇樣品的提取溶劑時(shí)，考慮到實(shí)驗(yàn)的安全性、成本和提取效率，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑。

提取時(shí)間和溫度對(duì)于樣品的提取效率影響很大。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，60℃條件下提取，燒瓶?jī)?nèi)的甲醇溶劑沸騰，溶劑蒸汽進(jìn)入冷凝管內(nèi)，冷卻后的液態(tài)溶劑回滴入提取器中，能夠起到溫浸的作用，而溫度繼續(xù)升高后，燒瓶?jī)?nèi)的甲醇溶液劇烈沸騰，提取溶液損失較大，所以選擇60℃作為熱回流提取溫度。熱回流提取2 h后，提取筒中提取液顏色較深，說明仍有物質(zhì)不斷地溶解在提取溶液中。提取4 h后提取筒中提取液顏色變得很淺。提取6 h后取筒中提取液顏色與4 h時(shí)沒有差異，說明果實(shí)中的物質(zhì)已經(jīng)完全被浸出。經(jīng)檢驗(yàn)熱回流提取4 h樹莓酮檢出量高于提取2 h，但與提取6 h后的樹莓酮檢出量相比較差異不大，所以本研究選擇4 h作為提取時(shí)間。

本研究建立了樹莓中樹莓酮含量檢測(cè)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析方法。不同基質(zhì)中樹莓酮的定量檢測(cè)限達(dá)到1.0 μg/kg，回收率為75.4%～82.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.97%～8.40%。本方法分析速度快，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于樹莓中樹莓酮的檢測(cè)。

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