固體發(fā)酵裂褶多糖免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤活性研究

鐘 葵， 佟立濤， 劉麗婭， 周閑容， 鐘 昕， 周素梅

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 北京 100193

裂褶多糖(schizophyllan，SPG)是藥用真菌裂褶菌(SchizophyllumcommuneFries)發(fā)酵產(chǎn)生的一種功能性葡聚糖，具有良好免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性[1]。研究表明SPG能增加遲發(fā)型皮膚過敏反應(yīng)、提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和抗羊紅細(xì)胞抗體數(shù)量，活化巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，提高肝癌小鼠TNF-和IL-2含量，提升細(xì)胞免疫功能[2～4]。此外，SPG能通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能達(dá)到殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的效果，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠S180腹水瘤和實(shí)體瘤、Lewis肺癌等均表現(xiàn)出良好腫瘤抑制活性[5,6]。在日本，SPG已作為一種抗腫瘤輔助藥品(西佐糖，Sizofiran)應(yīng)用于臨床，證實(shí)能夠活化巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，結(jié)合其他抗癌藥物能有效延長(zhǎng)胃癌和肺癌患者生命，與放療結(jié)合能提高Ⅱ、Ⅲ期子宮頸癌的免疫功效[7]。

目前關(guān)于裂褶多糖生物學(xué)活性的研究是基于裂褶菌子實(shí)體和深層培養(yǎng)的培養(yǎng)液中提取的SPG展開的，而固體發(fā)酵制備的SPG生物學(xué)活性尚未明確。我國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，每年產(chǎn)生2 000萬余t麥麩和4 000萬余t玉米芯，這些資源大部分被作為飼料或者直接廢棄、燃燒，造成資源浪費(fèi)，并對(duì)環(huán)境造成壓力。而采用麥麩和玉米芯等農(nóng)副產(chǎn)品資源為原料固體發(fā)酵生產(chǎn)裂褶多糖，多糖得率高(>9%)，原料成本低廉，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益良好[8,9]。因此，采用小麥麩皮和玉米芯等農(nóng)副產(chǎn)品資源固體發(fā)酵生產(chǎn)SPG，將廢棄物轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)附加值高的多糖產(chǎn)品，具有良好經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。

固體發(fā)酵制備SPG分子量較大(106～107Da)，黏度高，溶解性較差，嚴(yán)重影響其應(yīng)用，同時(shí)有報(bào)道表明大分子量SPG用于臨床注射治療時(shí)易出現(xiàn)肌肉疼痛和血栓等不良反應(yīng)[9]。本研究采用輻照方法處理天然固體發(fā)酵制備的SPG，降解其分子量，研究天然SPG和輻照后SPG(irradiated schizophyllan，ISPG)兩種裂褶多糖對(duì)體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性影響，為固體發(fā)酵制備SPG的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)支撐，旨在推動(dòng)其在保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源區(qū)劃研究所，菌種編號(hào)為ACCC51174(來源于東北)。

1.2 原料和試劑

試驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠(雄性，體重18～22 g)和豚鼠、綿羊血紅細(xì)胞(SRBC)和S180腫瘤細(xì)胞均購(gòu)于醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；雞血紅細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；醫(yī)藥級(jí)香菇多糖購(gòu)于山西泰盛制藥有限公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；其他常用化學(xué)試劑購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司(分析純)。

1.3 主要儀器

電熱恒溫水箱，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；Lgbofuge 400R低溫離心機(jī)，德國(guó)Thermo電子有限公司；TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DL-CI醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；NAPCO恒溫孵育箱，法國(guó)Jouang公司；正置熒光顯微鏡，德國(guó)Leica公司；CASY-TT細(xì)胞分析計(jì)數(shù)儀，德國(guó)Roche Innovatis AG公司；微孔板掃描酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；150 mm游標(biāo)卡尺，臺(tái)州市航宇工量刃具有限公司；XB-K-25血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠；1815TC型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Shellab公司。

1.4 裂褶多糖SPG和ISPG制備

裂褶菌菌種在PDA試管斜面上27℃培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)接液體種子培養(yǎng)基，27℃、160 r/min培養(yǎng)48 h后，按5 mL/100g(V/W)接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基(麥麩∶玉米芯粉=2∶8，水分含量50%)，27℃培養(yǎng)7～8 d，完成發(fā)酵。固體發(fā)酵菌塊于60℃烘干6 h，粉碎后按料水比1∶20配成水溶液，80℃熱水浴振蕩提取1 h，4 200 r/min離心20 min，取上清液，3倍體積乙醇沉淀過夜，過濾取沉淀；60℃烘干得到目標(biāo)多糖SPG[9]。10 kGy60Co輻照，得到目標(biāo)多糖ISPG[8]。

SPG和ISPG純度測(cè)定為78.25%±2.33%(干基計(jì))。

1.5 裂褶多糖SPG和ISPG分子量測(cè)定

按照鐘昕[8]方法測(cè)定裂褶多糖的重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)和分散系數(shù)(Mw/Mn)。采用Astra軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 裂褶多糖SPG和ISPG免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤活性測(cè)定

1.6.1S180腫瘤細(xì)胞活化和動(dòng)物模型建立 用生理鹽水將S180腫瘤細(xì)胞調(diào)為濃度3×106個(gè)/mL，腹腔接種于小鼠體內(nèi)，注射量為0.2 mL/只，飼養(yǎng)7 d進(jìn)行傳代。無菌條件下取接種S180細(xì)胞的小鼠腹水，加無菌生理鹽水稀釋，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為4.5×106個(gè)/mL，于小鼠右前肢腋下進(jìn)行無菌皮下接種，接種量為0.2 mL腫瘤細(xì)胞懸液。從取出腹水到接種完畢，時(shí)間控制2 h以內(nèi)[10]。

1.6.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥方式 建模成功的小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為模型組、陽性對(duì)照組、SPG樣品組和ISPG樣品組。兩個(gè)樣品組均設(shè)置高、中、低三個(gè)劑量，分別為1號(hào)(200 mg/kg體重·d)、2號(hào)(100 mg/kg體重·d)和3號(hào)(50 mg/kg體重·d)。模型組給予相同體積的蒸餾水，陽性對(duì)照組腹腔注射香菇多糖0.2 mg/kg，每2 d給藥1次，給藥時(shí)間為30 d。

1.7 療效評(píng)價(jià)

1.7.1體重增加測(cè)定 計(jì)算公式如下：

1.7.2羊血紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)測(cè)定 通過向給藥小鼠注射SRBC致敏，測(cè)定遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)情況。第一次注射在給藥第5 d，按0.2 mL/只腹腔注射2%(V/V)SRBC。第二次注射為4 d后，測(cè)量小鼠左后足趾部厚度，并在測(cè)量部位按20 μL/只皮下注射20%(V/V)SRBC，24 h后用再次測(cè)量小鼠左后足趾部厚度，同一部位測(cè)定3次，取平均值。DTH值及處理前后足趾厚度差值。當(dāng)受試樣品組顯著高于對(duì)照組時(shí)，判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.7.3脾細(xì)胞介導(dǎo)羊紅細(xì)胞定量溶血分光度實(shí)驗(yàn)(QHS) 按照鐘昕[8]方法，分別制備補(bǔ)體、SRBC懸液和脾細(xì)胞懸液。將0.25 mL SRBC，0.25 mL脾細(xì)胞懸液和0.25 mL補(bǔ)體混合，37℃反應(yīng)60 min，3 000 r/min離心3 min，吸取上清測(cè)定413 nm吸光值?？瞻讓?duì)照用生理鹽水代替補(bǔ)體。

1.7.4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞血紅細(xì)胞(CRBC)測(cè)定 按照Yang等[11]方法，通過向小鼠注射SRBC激活巨噬細(xì)胞，并在處死小鼠后，分離腹腔巨噬細(xì)胞，與雞血紅細(xì)胞(CRBC)懸液混合孵育，在載玻片上固定病染色后觀察計(jì)數(shù)。計(jì)100個(gè)細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞的個(gè)數(shù)即為巨噬細(xì)胞百分率。受試樣品組的巨噬細(xì)胞百分率與對(duì)照組比較，差異有顯著性，方可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.7.5抑瘤率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 荷瘤小鼠給藥30 d后，停藥24 h頸椎脫臼處死，固定于手術(shù)蠟板上，將小鼠右前肢腋下腫瘤剖出，稱量腫瘤重量并計(jì)算腫瘤抑制率，計(jì)算公式為：

腫瘤抑制率(%)=

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)方法， 顯著性水平為P<0.05。整個(gè)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 9.0軟件，制圖采用OriginPro 7.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂褶多糖SPG和ISPG分子量測(cè)定

采用GPC-LLS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定SPG和ISPG重均分子量(Mw)和數(shù)均分子量(Mn)，結(jié)果如表1所示。天然SPG和輻照處理后ISPG樣品均含有3個(gè)級(jí)分，但兩者分子量差異較大。SPG分子量在106～107Da之間，其中Mw為4.65×107Da的級(jí)分含量最高，質(zhì)量百分比為55.5%；其他兩個(gè)級(jí)分分子量較低，分別為8.43×106Da和3.56×106Da，質(zhì)量百分比分別為21.2%和13.5%。10 kGy輻照處理后多糖分子量顯著下降，質(zhì)量百分比最高的級(jí)分(60.5%)分子量Mw下降至2.97×105Da；另外兩個(gè)級(jí)分分子量均為104Da左右，分別為4.77×104Da(21.9%)和1.26×104Da(17.6%)。

表1 裂褶多糖分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of SPG and ISPG.

2.2 裂褶多糖生物學(xué)活性研究

2.2.1小鼠體重變化結(jié)果分析 試驗(yàn)期間不同組別S180荷瘤小鼠體重增加結(jié)果如圖1所示。試驗(yàn)30 d期間，模型組小鼠體重增加了12.37%±1.67%，SPG和ISPG不同劑量組體重增加與模型組沒有顯著差異，香菇多糖組體重平均增加13.99%±1.33%，與模型組體重增加差異不顯著(P>0.05)。因此，試驗(yàn)期間各組別之間小鼠體重增加均沒有顯著差異(P>0.05)。

圖1 裂褶多糖SPG和ISPG對(duì)S180荷瘤小鼠體重增加影響Fig.1 Effect of SPG and ISPG on weight gain of S180 tumor mice.注：SPG1/ISPG1：高劑量組200 mg/kg體重·d；SPG2/ISPG2：中劑量組100 mg/kg體重·d；SPG3/ISPG3：低劑量組50 mg/kg體重·d。不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2.2裂褶多糖對(duì)S180荷瘤小鼠羊血紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)影響研究 DTH反應(yīng)是由抗原誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞激活并產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和組織細(xì)胞損傷為主要特征的局部炎癥反應(yīng)[12]。SRBC可刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞， 4天后再以SRBC對(duì)小鼠足趾部細(xì)胞進(jìn)行攻擊時(shí)，該部位出現(xiàn)腫脹，且腫脹程度可反映細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)程度[13]。圖2是裂褶多糖SPG和ISPG對(duì)S180荷瘤小鼠SRBC誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響。由圖可見，模型組的足趾腫脹度僅為0.33±0.05 mm，香菇多糖組和實(shí)驗(yàn)多糖組處理后小鼠足趾腫脹度均顯著提高(P<0.05)。SPG三個(gè)劑量處理后小鼠足趾腫脹度均顯著高于模型組(P<0.05)，其中低劑量組(SPG3)足趾腫脹度最高(0.56±0.05 mm)，但與中和低劑量組差異不顯著(P>0.05)。ISPG中和低劑量處理組足趾腫脹度顯著高于模型組(P<0.05)，但高劑量組(0.40±0.08 mm)與模型組之間沒有顯著差異(P>0.05)。對(duì)照香菇多糖組小鼠足趾腫脹度為0.51±0.06 mm，顯著高于模型組(P<0.05)，但與SPG和ISPG各劑量組沒有顯著差異(P>0.05)。

圖2 裂褶多糖SPG和ISPG對(duì)S180荷瘤小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)影響Fig.2 Effect of SPG and ISPG on delayed type hypersensitivity(DTH)of S180 tumor mice.注：SPG1/ISPG1：高劑量組200 mg/kg體重·d；SPG2/ISPG2：中劑量組100 mg/kg體重·d；SPG3/ISPG3：低劑量組50 mg/kg體重·d。不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2.3裂褶多糖對(duì)S180荷瘤小鼠脾細(xì)胞介導(dǎo)羊紅細(xì)胞定量溶血分光度影響研究 QHS值反映機(jī)體體液特異性免疫性能，數(shù)值越高表明機(jī)體免疫力越強(qiáng)。SPG和ISPG對(duì)S180荷瘤小鼠QHS值結(jié)果如圖3所示。空白模型組QHS值為0.83±0.04，香菇多糖和裂褶多糖組的QHS值顯著提高(P<0.05)。除SPG高劑量組外，SPG中和低劑量組、ISPG三個(gè)劑量組QHS值均顯著高于模型組(P<0.05)；其中ISPG中劑量組QHS值最高，達(dá)到1.06±0.14，但不同組別之間QHS值差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照香菇多糖組QHS值(1.03±0.06)顯著高于模型組(P<0.05)，但與SPG中和低劑量組、ISPG三個(gè)劑量組之間沒有顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，SPG和ISPG均能顯著提高小鼠體液特異性免疫性能。

圖3 裂褶多糖SPG和ISPG對(duì)S180荷瘤小鼠脾細(xì)胞介導(dǎo)羊紅細(xì)胞(QHS)影響Fig.3 Effect of SPG and ISPG on Spleen cell-mediated quantitative hemolysis spectrophotometry (QHS) of the S180 tumor mice.注：SPG1/ISPG1：高劑量組200 mg/kg體重·d；SPG2/ISPG2：中劑量組100 mg/kg體重·d；SPG3/ISPG3：低劑量組50 mg/kg體重·d。不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2.4裂褶多糖對(duì)S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞血紅細(xì)胞影響研究 巨噬細(xì)胞(MФ)是具有多種功能的重要免疫細(xì)胞，通過處理抗原和釋放可溶性因子達(dá)到調(diào)節(jié)免疫效果。激活的巨噬細(xì)胞不僅參與特異性和非特異性免疫反應(yīng)，同時(shí)也是兩種免疫反應(yīng)的“橋梁細(xì)胞”[14]。裂褶多糖SPG和ISPG對(duì)S180荷瘤小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞雞血紅細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞百分比13.00%±0.91%，SPG三個(gè)劑量組的吞噬效果與模型組沒有顯著差異(P>0.05)；ISPG中劑量組能顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞(P<0.05)吞噬百分比達(dá)到18.33%±0.58%，但低劑量和高劑量組吞噬效果與模型組沒有顯著差異(P>0.05)。香菇多糖組吞噬雞紅細(xì)胞效果顯著高于模型組(18.67±2.07%)，但與ISPG中劑量組差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，ISPG能顯著增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫功能。

圖4 裂褶多糖SPG和ISPG對(duì)S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅血細(xì)胞影響Fig.4 Effect of SPG and ISPG on phagocytosis of macrophage test of the S180 tumor mice.注：SPG1/ISPG1：高劑量組200 mg/kg體重·d；SPG2/ISPG2：中劑量組100 mg/kg體重·d；SPG3/ISPG3：低劑量組50 mg/kg體重·d。不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2.5裂褶多糖對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤抑制效果影響研究 裂褶多糖對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤抑制效果如圖5所示，SPG和ISPG均對(duì)S180荷瘤小鼠有良好的腫瘤抑制效果，抑瘤率達(dá)45%以上。不同劑量組之間抑瘤率差異顯著，ISPG中劑量組抑瘤率最高(74.80%±6.83%)，顯著高于ISPG高劑量組和SPG高、中劑量組(P<0.05)，但與ISPG低劑量組和SPG低劑量組差異不顯著(P>0.05)；ISPG高劑量組抑瘤率最低，為45.76%±5.09%。對(duì)照香菇多糖抑瘤率為52.17%±5.10%，顯著低于SPG低劑量組和ISPG中、低劑量組(P<0.05)，但與ISPG高劑量組和SPG高和中劑量組差異不顯著(P>0.05)。

圖5 裂褶多糖對(duì)S-180荷瘤小鼠的腫瘤抑制率Fig.5 Antitumor inhibition of SPG and ISPG in S180 tumor mice.注：SPG1/ISPG1：高劑量組200 mg/kg體重·d；SPG2/ISPG2：中劑量組100 mg/kg體重·d；SPG3/ISPG3：低劑量組50 mg/kg體重·d。不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

3 討論

天然SPG樣品含有三個(gè)級(jí)分，分子量在106～107Da之間，其中以4.65×107Da的級(jí)分含量最高，質(zhì)量百分比為55.5%；其他兩個(gè)級(jí)分分子量分別為8.43×106Da和3.56×106Da，質(zhì)量百分比分別為21.2%和13.5%。10 kGy輻照處理后的ISPG分子量顯著降低，質(zhì)量百分比最高級(jí)分(60.5%)的分子量下降至2.97×105Da；另兩個(gè)級(jí)分分子量分別為4.770×104Da(21.9%)和1.261×104Da(17.6%)。說明輻照能有效降低固體發(fā)酵制備裂褶菌多糖分子量。

相對(duì)模型組，樣品各劑量組均對(duì)小鼠體重沒有顯著性影響；SPG和ISPG中(100 mg/kg體重·d)和低劑量(50 mg/kg體重·d)組均能顯著增強(qiáng)S180荷瘤小鼠DTH反應(yīng)，提高荷瘤小鼠體液特異性免疫性能(QGS值)；ISGP中劑量組(100 mg/kg體重·d)能顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞效果，提升小鼠非特異性免疫功能。SPG和ISPG均對(duì)S180荷瘤小鼠均具有良好的腫瘤抑制效果，ISPG中劑量組(100 mg/kg體重·d)抑瘤率最高(74.80%±6.83%)，ISPG低劑量組和SPG低劑量組抑瘤率均在70%左右，顯著高于陽性對(duì)照香菇多糖組(52.17%±5.10%)。總體看來，輻照處理后的ISPG比天然SPG具有更好的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤活性。

參 考 文 獻(xiàn)

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