利用腸桿菌基因間重復(fù)序列PCR（ERIC-PCR）方法對阪崎克羅諾桿菌進行分子分型

陳萬義，艾連中，任 婧，穆海波

（光明乳業(yè)股份有限公司 光明乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海 200436）

0 前言

阪崎克羅諾桿菌是人和動物腸道內(nèi)寄生的一種革蘭陰性無芽孢桿菌.直至1980年，其被鑒定命名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），歸屬于腸桿菌科腸桿菌屬，并包括15個生物型[1].2008年，Iversen等[2-3]根據(jù)16S rRNA基因序列、核糖體分型、熒光擴增片段長度多態(tài)性（fluorescent-amplified fragment length polymorphism，f-AFLP） 和 DNADNA雜交試驗對阪崎腸桿菌重新進行系統(tǒng)學(xué)分類，建議將該菌定義為一個新的屬，即克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp）.屬內(nèi)包括 5個新種（其中Cronobacter sakazakii稱為新組合）和1個克羅諾桿菌基因種，即阪崎克羅諾桿菌、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌、穆汀斯克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、克羅諾桿菌基因種1.

作為一種重要的食源性條件致病菌，阪崎克羅諾桿菌能夠引起嬰兒致命的感染，致死率高達10%～80%.它通常能導(dǎo)致嬰兒嚴(yán)重的臨床癥狀，例如腦膿瘍、腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和全身性敗血癥.出生兩個月之內(nèi)的新生嬰兒或早產(chǎn)兒都存在通過食用污染有克羅諾桿菌屬的嬰兒配方粉而感染阪崎克羅諾桿菌的風(fēng)險[4].2004年我國安徽阜陽劣質(zhì)嬰兒配方粉事件引起了我國政府的高度重視.這也是國內(nèi)首次從嬰兒配方粉中分離到阪崎克羅諾桿菌菌株[5].

雖然在許多臨床感染病例中尚不能確定阪崎克羅諾桿菌真正的宿主，同時阪崎克羅諾桿菌也曾在其他食品中檢出，而且沖調(diào)環(huán)境和器皿的污染也是重要的傳染源，但越來越多的報道證明嬰兒配方粉是主要的傳染源和傳播媒介，并且只有嬰兒配方奶粉（powdered infant formula，PIF）與疾病的暴發(fā)相關(guān)[6].

目前，研究發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌屬菌株在自然界中分布廣泛，已發(fā)現(xiàn)的生存地點為純凈水、土壤、污水、香草和蔬菜，同時動物和人的糞便也是該菌的生存地之一[7].克羅諾桿菌屬內(nèi)6個種對化學(xué)物質(zhì)的敏感性以及溫度和抗生素方面存在較大的差異[8]，而且各個菌的致病因子在特定情況下的表達也各不相同[9-10]，從而導(dǎo)致的致病力大小也不盡相同.因此，克羅諾桿菌屬菌株水平上的快速準(zhǔn)確的鑒定和分型方法對于控制由該屬引起的食源性疾病的監(jiān)控、預(yù)防和控制具有十分重要的意義.同時，對于分子流行病學(xué)的研究也是至關(guān)重要的.傳統(tǒng)的分型方法主要包括：生物型[1]、血清型、質(zhì)粒分型，它們已經(jīng)難以滿足當(dāng)今快速溯源技術(shù)的要求.越來越多的基因分型方法已經(jīng)被用于克羅諾桿菌屬內(nèi)菌株的分子分型，包括核糖體分型[11]、隨機擴增DNA片段多態(tài)性分析（RAPD）[12]、腸桿菌基因間回文重復(fù)序列PCR（REP-PCR）[13]、隨機片段長度多態(tài)性分析（AFLP）[2]和脈沖場凝膠電泳（PFGE）[14].分子分型技術(shù)產(chǎn)生的DNA指紋圖譜比傳統(tǒng)的生物型具有更高的分辨率和可靠性.本研究主要采用腸桿菌間保守重復(fù)序列PCR（ERIC-PCR）對43株克羅諾桿菌屬菌株和5株腸桿菌屬菌株進行分子分型，期望建立一種適合用于我國阪崎克羅諾諾桿菌快速溯源的的分子分型方法.

表1 試驗菌株

1 材料與方法

1.1 材料

本次試驗共使用了43株克羅諾桿菌屬菌株，其中8株為模式菌株（由上海出入境檢驗檢疫局惠贈），剩余35株為食品分離菌株，另外5株為腸桿菌菌株，其中3株為模式菌株（購買于中國微生物菌種保藏中心），2株為分離菌株（見表1）.

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試劑

溶菌酶、蛋白酶K和RNAseA均為Sigma進口分裝；CTAB、SDS、NaCl、苯酚、乙醇、氯仿和異戊醇等均為國產(chǎn)分析純；瓊脂糖為西班牙分裝；DNA Marker為北京天根生物科技有限公司.

1.2.2 儀器

PCR 儀：ABI Veriti 96 well thermal cycler，美國生命科技有限公司；核酸測定儀：Thermo Scientific，NANODROP 2000C，基因儀器有限公司；凝膠成像儀：BIO-RAD公司，美國.

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取及濃度測定

采用CTAB法[15]提取43株克羅諾桿菌屬菌株和5株腸桿菌屬菌株.將提取好的DNA原液用核酸測定儀進行濃度的測定，并將所有的DNA原液稀釋到40 ng/μL用于ERIC-PCR試驗.

1.3.2 ERIC-PCR

該試驗引用文獻[16]報道的一對22 bp的上下游引物，其中上游引物為ERIC 1R（5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C3’），下游引物為ERIC 2 （5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTGAGC G-3’）.25μL PCR反應(yīng)體系中含有2.5μL10×PCR反應(yīng)緩沖 液 ，2 μL 2.5 mmol/L Mg2+，1 μL 2.5 mmol/L DNTP，1μL含有正向和反向引物（10μmol/L）的混合液，以及2μL的模板DNA.PCR反應(yīng)條件如下：95℃ 5 min以完全激活 Taq DNA聚合酶，變性：94℃ 45 s；退火：52℃ 1 min；延伸：72℃5min；此過程共進行35個 循環(huán)；此后在72℃下繼續(xù)延伸 10 min.PCR擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上以恒流80 A、電泳50 min后，溴化乙啶（EB）染色15 min后在凝膠成像儀觀察并保存結(jié)果（圖像格式保存成TIFF格式）.

1.3.3 數(shù)據(jù)數(shù)理

ERIC-PCR電泳圖譜結(jié)果采用數(shù)學(xué)軟件BioN-umericus version 5.0（Applied Maths，Belgium）進行分析，根據(jù)非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)聚類法（unweightedpair group method using average linkages，UPGMA）進行聚類分析，產(chǎn)生一個相似度矩陣，基于相似度矩陣構(gòu)建一個最小生成樹（分子進化樹狀圖）.該基因分型方法的分辨能力的大小計算是根據(jù)辛普森多樣性方程[17]進行分析的，即根據(jù)D值大小判斷分辨率的大小，一般情況下D值大于0.9表明分辨率較高，反之，說明分辨率較低.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA濃度均一化

使用CTAB法提取的基因組DNA濃度和純度都較高，而且都稀釋到相同的濃度（40 ng/μL）進行3次相同的重復(fù)試驗，高質(zhì)量和高純度的DNA保證了ERIC-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性.

2.2 ERIC-PCR電泳結(jié)果分析

對分子流行病學(xué)上不相關(guān)的43株克羅諾桿菌屬菌株和5株腸桿菌屬菌株進行ERIC-PCR分型后，都能夠擴增出大小及數(shù)目不同的條帶.從瓊脂糖凝膠電泳圖譜（圖1）上可以明顯看出：條帶數(shù)目為5～10，擴增的片段長度大都在150～4 000 bp之間，而且分子量為1 500 bp，2 000 bp和3 100 bp的擴增片段存在于大多數(shù)菌株中.

圖1 43株克羅諾桿菌屬菌株和5株腸桿菌菌株中部位代表菌株的ERIC-PCR電泳圖譜

2.3 聚類分析

43株克羅諾桿菌屬菌株和5株腸桿菌屬菌株的ERIC-PCR電泳圖譜經(jīng)Bionumericus version 5.0軟件分析后，根據(jù)相似性值大于80%可以將48株菌株分成36個不同的類群（Cluster），詳見圖 2.根據(jù)非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)聚類法 （UPGMA）進行聚類分析，構(gòu)建了所有菌株之間的分子進化樹狀圖譜（圖2），從圖2可以明顯看出，克羅諾桿菌屬菌株和腸桿菌屬菌株分別聚成一類，表明它們之間的遺傳相似性較遠(yuǎn).

2.4 分辨率

43株克羅諾桿菌屬菌株和5株腸桿菌屬菌株的ERIC-PCR電泳圖譜經(jīng)數(shù)學(xué)軟件BioNumerics version 5.0處理后，如果根據(jù)相似性值大于0.80，經(jīng)辛普森多樣性方程計算得到ERIC-PCR分型的分辨系數(shù)是0.984（D=0.984），這表明ERIC-PCR方法的分辨率相對較高，能夠用于我國克羅諾桿菌屬菌株分離菌株的亞種分型.

3 結(jié)論與討論

分子分型在食物中毒事件調(diào)查中，可鑒別和排除那些與暴發(fā)不相關(guān)的菌株，精煉暴發(fā)數(shù)據(jù)流行病學(xué)分析.目前分子分型的方法有多種，具有不同的適用范圍，ERIC-PCR作為其中的一種技術(shù)，由于操作簡便，分辨率高，在細(xì)菌分子流行病學(xué)溯源領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[18].

圖2 43株克羅諾桿菌屬菌株和5株腸桿菌菌株ERIC-PCR電泳圖譜經(jīng)BioNUmericus軟件根據(jù)UPGMA方法構(gòu)建的分子進化樹狀圖譜

目前，細(xì)菌分子分型中比較常用的分子分型方法是核糖體分型（Ribotyping）和脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型.盡管核糖體分型技術(shù)已經(jīng)成功地被引入到多種細(xì)菌種間鑒別和分型之中[19].然而，核糖體分型通常產(chǎn)生的條帶數(shù)目較少，因此分辨率相對較低，而且結(jié)果解釋起來相對簡單一些，并且對某些屬的細(xì)菌難以將種水平上的差異區(qū)別開來.PFGE具有高的分辨率和較好的重復(fù)性，一直以來被認(rèn)為是對病原微生物進行流行病學(xué)研究和調(diào)查的“金標(biāo)準(zhǔn)”[20]，廣泛用于對多種細(xì)菌進行分型和鑒定.然而PFGE也有自身的缺陷，總有一小部分菌株無法進行PFGE分型，而且有時候這部分菌株所占的比例相對較大（23%）[18]，這可能是由于在酶切過程或其他處理步驟中導(dǎo)致DNA的降解，從而無法得到令人滿意的結(jié)果.ERIC-PCR最早應(yīng)用于腸桿菌科腸桿菌屬細(xì)菌的分子分型中，后來發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌染色體上也存在這種重復(fù)序列，因此陸續(xù)被引入到其他多種細(xì)菌的分型鑒定中[18].由于ERIC-PCR相對PFGE是一種更加快速和操作簡便的方法，因此對于大規(guī)模菌株的流行病學(xué)調(diào)查和關(guān)鍵點監(jiān)控是非常適用的.然而，有時候一些擴增條帶較弱，因此會給結(jié)果的判讀帶來一定的困難，并且有可能造成結(jié)果難以重復(fù).因此，如果需要更加準(zhǔn)確快速和高分辨率的分型方法時，聯(lián)合其他的方法可能更加有效.對于親緣關(guān)系更加密切的菌株之間的進化關(guān)系的分析，則需要結(jié)合目前分辨率較高的MLST來進行菌株之間的分型鑒定[21].

通過本次研究證明ERIC-PCR是一種適合用于我國阪崎克羅諾諾桿菌快速溯源的分子分型方法.根據(jù)非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)聚類法（UPGMA）利用BioNumericus軟件進行聚類分析，構(gòu)建了流行病學(xué)無相關(guān)性的不同來源的食品分離株和臨床致病菌株之間的分子進化樹狀圖譜，根據(jù)分子進化樹狀圖譜可以明顯看出阪崎克羅諾桿菌不同來源分離菌株之間存在較大的基因多樣性.該方法不但可以快速比較阪崎克羅諾桿菌分離菌株之間分子流行病學(xué)上的相關(guān)性，還可以進一步了解克羅諾桿菌屬內(nèi)不同來源分離菌株之間的分子進化關(guān)系.

細(xì)菌的分子分型已經(jīng)廣泛用于食源性病原菌流行病學(xué)研究和追溯其傳播途徑的研究之中.由于克羅諾桿菌屬內(nèi)菌株之間在表型上具有高度的一致性，因此傳統(tǒng)的分型方法，例如生物學(xué)分型、血清學(xué)分型或質(zhì)粒分型[11]，已經(jīng)不適用于其種間多樣性差異的鑒別，這就迫切需要發(fā)展分辨率更高的基因分型方法用于阪崎克羅諾桿菌種間多樣性的區(qū)別，及時發(fā)現(xiàn)其傳染源，切斷其傳播途徑，從而可以防患于未然.

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