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    蕨菜乙醇提取物的Ames試驗(yàn)研究

    2013-12-09 08:37:14陳乃富谷仿麗陳乃東
    中國野生植物資源 2013年6期
    關(guān)鍵詞:試物組氨酸蕨菜

    陳乃富,谷仿麗,陳乃東,戴 軍

    蕨菜是采自蕨科蕨屬中蕨(Pteridium aquilinum L.)的幼嫩葉,已有研究表明蕨菜乙醇提取物中黃酮類化合物含量較高,可達(dá)干蕨菜粉的7.28%[1],且具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等作用[1-4]。但目前關(guān)于該提取物的致突變研究未見報(bào)道。為此,我們用改良的Ames試驗(yàn)對蕨菜乙醇提取物的致突變進(jìn)行研究,以判斷其是否具有致突變作用,為蕨菜的開發(fā)利用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 儀器 旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器、TU1201分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、液氮罐、高壓滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、微量注射器、常用接種工具、培養(yǎng)皿及常用玻璃儀器。

    1.1.2 試劑 牛肉膏、混合蛋白胨、D-生物素、L-組氨酸、氨芐青霉素、結(jié)晶紫、四環(huán)素、二甲基亞砜(DMSO)、輔酶 -Ⅱ、葡萄糖 -6-磷酸鈉鹽、玉米油、敵克松(Dexon)、2-乙酰氨基芴(2-AF)及相關(guān)常用試劑等。

    1.1.3 受試物 蕨菜乙醇提取物,本實(shí)驗(yàn)室自制,冰箱冷藏。

    1.1.4 菌株 鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102由安徽醫(yī)科大學(xué)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。因突變型菌的某些特性易丟失或變異,因此,在使用前按照文獻(xiàn)[5]中方法進(jìn)行鑒定,4種菌株鑒定結(jié)果均合格。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 受試物的制備和組氨酸含量測定 ①受試物的制備:蕨菜干粉經(jīng)乙醚脫脂后,用70%乙醇、80℃、料液比1:15提取兩次,合并濾液,回收乙醇,得深褐色漿狀物。②受試物中組氨酸含量測定:本實(shí)驗(yàn)所用菌株為組氨酸缺陷型,要求根據(jù)受試物系中是否含組氨酸來確定是否設(shè)定組氨酸對照組。按照文獻(xiàn)[6]方法測得受試物中不含組氨酸量,因此,本實(shí)驗(yàn)無需設(shè)組氨酸對照組。

    1.2.2 活化系統(tǒng)(S9和 S9混合液)的制備[7-8]①大鼠肝S9的誘導(dǎo)和制備:健康雄性SD大鼠,體重150 g左右,鼠齡約5~6周。將β-萘黃酮、注射用苯巴比妥鈉溶于玉米油中,濃度為200 mg·mL-1,按500 mg·kg-11次腹腔注射,5天后斷頭處死動(dòng)物,取出肝臟,濾紙吸干表面液體,稱重后,用新鮮冰冷的0.15 mol/L氯化鉀溶液連續(xù)沖洗肝臟數(shù)次,每1 g肝(濕重)加0.1 mol/L氯化鉀溶液3 mL,連同燒杯移入冰浴中,用消毒剪刀剪碎肝臟,組織勻漿器(20 000 r/min,1 min)中制成肝勻漿。以上操作均在無菌和局部低溫環(huán)境中進(jìn)行。將制成的肝勻漿在低溫(0~4℃)高速離心機(jī)上以12 000 r/min離心10 min,吸出上清液為S9組分,分裝后液氮保存。②S9肝液中的蛋白含量測定:根據(jù)Lowry法測S9肝液中的蛋白含量。將①制備中S9肝液稀釋100倍后測定其蛋白質(zhì)含量為0.111 mg/mL,符合實(shí)驗(yàn)要求[5]。③10%S9混合液由S9液和輔助因子(S9混合液試劑)組成。

    1.2.3 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))(平板滲入法)[5]①分組:實(shí)驗(yàn)分為加S9與不加S92大類。每個(gè)類別中又將受試物分為5個(gè)劑量組,設(shè)陰性對照(自發(fā)回變)、溶劑對照以及陽性對照3個(gè)對照組,每個(gè)組別設(shè)3個(gè)平行皿進(jìn)行同步實(shí)驗(yàn)。陰性對照(自發(fā)回變)組只在培養(yǎng)基上加菌液,溶劑對照組為添加二甲基亞砜(DMSO),不加S9的陽性對照物為敵克松(Dexon),加S9的陽性對照物為2-乙酰氨基芴(2-AF)。5個(gè)劑量組分別為每皿50、100、200、400、800 μg受試物。具體操作為將受試物溶于頂層培養(yǎng)基中,放入45℃恒溫水浴保溫,再依次加入測試菌株新鮮菌液0.1 mL、S9混合液0.25 mL,混勻,迅速傾入底層培養(yǎng)基上,使之均勻分布在底層培養(yǎng)基上,平放固化。②培養(yǎng)條件和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):接種固化后的平皿置于37℃下的恒溫箱培養(yǎng)48 h,計(jì)每皿菌落數(shù)。整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果與分析

    兩次試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下,見表1,隨著受試物劑量的增加,突變菌落數(shù)隨之增加,但受試物各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過陰性對照(自發(fā)回變)菌落數(shù)的2倍,且無劑量-反應(yīng)關(guān)系,說明不論加與不加S9,受試物對鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗(yàn)菌株均未呈現(xiàn)致突變性[9]。而陽性對照組各菌株回變菌落平均數(shù)均超過其相應(yīng)陰性對照組回變菌落平均數(shù)的2倍以上,證實(shí)鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株對受試物的檢測有效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明蕨菜乙醇提取物無致突變作用。

    表1 蕨菜乙醇提取物的Ames試驗(yàn)菌株的回變結(jié)果(X±S)

    3 討論

    Ames試驗(yàn)是由Ames在1975年建立的鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn),是一種已被公認(rèn)并廣泛采納的致突變鑒定方法[8]。蕨采乙醇提取物中的主要有效成分為黃酮類化合物,對細(xì)胞氧化系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用[1,3-4],提示其有一定的開發(fā)價(jià)值,但無論是保健品還是藥品開發(fā),其安全性評價(jià)是非常重要的。本實(shí)驗(yàn)研究表明蕨菜乙醇提取物在一定的劑量范圍內(nèi)不具有致突變作用,有著進(jìn)一步深入研究和開發(fā)的價(jià)值。

    [1] 陳乃富.蕨菜黃酮類化合物的提取及其抗氧化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(11):63 -66.

    [2] 陳乃富,張莉.蕨菜黃酮類化合物的提取與分析[J].中國林副特產(chǎn),2004(6):1-4.

    [3] 陳乃富,黃新華,季洪武.蕨菜黃酮對小鼠體內(nèi)丙二醛含量的影響[J].生物學(xué)雜志,2006,23(4):30 -33.

    [4] 陳乃富,季洪武,黃新華.蕨菜黃酮對環(huán)境脅迫因子(鉛)引起的小鼠細(xì)胞氧化的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2007,13(2):120-123.

    [5] 杜文欣.現(xiàn)代保健食品研發(fā)與和生產(chǎn)新技術(shù)新工藝及注冊申報(bào)實(shí)用手冊:第4卷[M].北京:中國科技文化出版社,2005:1514-1524.

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    [8] 李奇慧,朱明學(xué),張黎明,等.硫芥誘導(dǎo)小鼠染色體畸變和微核形成作用研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)報(bào),2004,26(19):1701-1703.

    [9] 馬茂才,黃萍,晏輝,等.納米二氧化鈦和納米鋅的Ames試驗(yàn)[J].癌變·畸變·突變,2010,22(4):302-304.

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