蕨菜乙醇提取物的Ames試驗(yàn)研究

陳乃富，谷仿麗，陳乃東，戴 軍

蕨菜是采自蕨科蕨屬中蕨(Pteridium aquilinum L.)的幼嫩葉，已有研究表明蕨菜乙醇提取物中黃酮類化合物含量較高，可達(dá)干蕨菜粉的7.28%［1］，且具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等作用［1－4］。但目前關(guān)于該提取物的致突變研究未見報(bào)道。為此，我們用改良的Ames試驗(yàn)對蕨菜乙醇提取物的致突變進(jìn)行研究，以判斷其是否具有致突變作用，為蕨菜的開發(fā)利用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器、TU1201分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、液氮罐、高壓滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、微量注射器、常用接種工具、培養(yǎng)皿及常用玻璃儀器。

1.1.2 試劑 牛肉膏、混合蛋白胨、D－生物素、L－組氨酸、氨芐青霉素、結(jié)晶紫、四環(huán)素、二甲基亞砜(DMSO)、輔酶 －Ⅱ、葡萄糖 －6－磷酸鈉鹽、玉米油、敵克松(Dexon)、2－乙酰氨基芴(2－AF)及相關(guān)常用試劑等。

1.1.3 受試物 蕨菜乙醇提取物，本實(shí)驗(yàn)室自制，冰箱冷藏。

1.1.4 菌株 鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102由安徽醫(yī)科大學(xué)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。因突變型菌的某些特性易丟失或變異，因此，在使用前按照文獻(xiàn)［5］中方法進(jìn)行鑒定，4種菌株鑒定結(jié)果均合格。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 受試物的制備和組氨酸含量測定 ①受試物的制備:蕨菜干粉經(jīng)乙醚脫脂后，用70%乙醇、80℃、料液比1:15提取兩次，合并濾液，回收乙醇，得深褐色漿狀物。②受試物中組氨酸含量測定:本實(shí)驗(yàn)所用菌株為組氨酸缺陷型，要求根據(jù)受試物系中是否含組氨酸來確定是否設(shè)定組氨酸對照組。按照文獻(xiàn)［6］方法測得受試物中不含組氨酸量，因此，本實(shí)驗(yàn)無需設(shè)組氨酸對照組。

1.2.2 活化系統(tǒng)(S9和 S9混合液)的制備［7－8］①大鼠肝S9的誘導(dǎo)和制備:健康雄性SD大鼠，體重150 g左右，鼠齡約5～6周。將β－萘黃酮、注射用苯巴比妥鈉溶于玉米油中，濃度為200 mg·mL－1，按500 mg·kg－11次腹腔注射，5天后斷頭處死動(dòng)物，取出肝臟，濾紙吸干表面液體，稱重后，用新鮮冰冷的0.15 mol/L氯化鉀溶液連續(xù)沖洗肝臟數(shù)次，每1 g肝(濕重)加0.1 mol/L氯化鉀溶液3 mL，連同燒杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝臟，組織勻漿器(20 000 r/min，1 min)中制成肝勻漿。以上操作均在無菌和局部低溫環(huán)境中進(jìn)行。將制成的肝勻漿在低溫(0～4℃)高速離心機(jī)上以12 000 r/min離心10 min，吸出上清液為S9組分，分裝后液氮保存。②S9肝液中的蛋白含量測定:根據(jù)Lowry法測S9肝液中的蛋白含量。將①制備中S9肝液稀釋100倍后測定其蛋白質(zhì)含量為0.111 mg/mL，符合實(shí)驗(yàn)要求［5］。③10%S9混合液由S9液和輔助因子(S9混合液試劑)組成。

1.2.3 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))(平板滲入法)［5］①分組:實(shí)驗(yàn)分為加S9與不加S92大類。每個(gè)類別中又將受試物分為5個(gè)劑量組，設(shè)陰性對照(自發(fā)回變)、溶劑對照以及陽性對照3個(gè)對照組，每個(gè)組別設(shè)3個(gè)平行皿進(jìn)行同步實(shí)驗(yàn)。陰性對照(自發(fā)回變)組只在培養(yǎng)基上加菌液，溶劑對照組為添加二甲基亞砜(DMSO)，不加S9的陽性對照物為敵克松(Dexon)，加S9的陽性對照物為2－乙酰氨基芴(2－AF)。5個(gè)劑量組分別為每皿50、100、200、400、800 μg受試物。具體操作為將受試物溶于頂層培養(yǎng)基中，放入45℃恒溫水浴保溫，再依次加入測試菌株新鮮菌液0.1 mL、S9混合液0.25 mL，混勻，迅速傾入底層培養(yǎng)基上，使之均勻分布在底層培養(yǎng)基上，平放固化。②培養(yǎng)條件和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):接種固化后的平皿置于37℃下的恒溫箱培養(yǎng)48 h，計(jì)每皿菌落數(shù)。整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

兩次試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下，見表1，隨著受試物劑量的增加，突變菌落數(shù)隨之增加，但受試物各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過陰性對照(自發(fā)回變)菌落數(shù)的2倍，且無劑量－反應(yīng)關(guān)系，說明不論加與不加S9，受試物對鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗(yàn)菌株均未呈現(xiàn)致突變性［9］。而陽性對照組各菌株回變菌落平均數(shù)均超過其相應(yīng)陰性對照組回變菌落平均數(shù)的2倍以上，證實(shí)鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株對受試物的檢測有效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明蕨菜乙醇提取物無致突變作用。

表1 蕨菜乙醇提取物的Ames試驗(yàn)菌株的回變結(jié)果(X±S)

3 討論

Ames試驗(yàn)是由Ames在1975年建立的鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)，是一種已被公認(rèn)并廣泛采納的致突變鑒定方法［8］。蕨采乙醇提取物中的主要有效成分為黃酮類化合物，對細(xì)胞氧化系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用［1，3－4］，提示其有一定的開發(fā)價(jià)值，但無論是保健品還是藥品開發(fā)，其安全性評價(jià)是非常重要的。本實(shí)驗(yàn)研究表明蕨菜乙醇提取物在一定的劑量范圍內(nèi)不具有致突變作用，有著進(jìn)一步深入研究和開發(fā)的價(jià)值。

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