響應(yīng)面法優(yōu)化Enterobacter sp.SYA2乳糖酶發(fā)酵工藝

張衛(wèi)兵，文鵬程，劉芳寧，艾對(duì)元，贠建民，張 炎，梁 琪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)又稱β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，能夠催化β-D-半乳糖苷鍵發(fā)生水解，還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷活性，在乳品、醫(yī)藥、分析、環(huán)境保護(hù)等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其有利于“乳糖不耐受癥”［1］。乳糖酶來源廣泛，可以從多種微生物、植物和動(dòng)物體中獲得。利用微生物發(fā)酵法獲取乳糖酶的方法具有操作方便、生產(chǎn)效率高、適用于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［2］。培養(yǎng)基的成分對(duì)于微生物發(fā)酵產(chǎn)酶有重要的影響，通常用于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的方法有單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)等［3］。Plackett-Burman法適用于從眾多的過程變量中快速、有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素［4］。Williams將其與隨機(jī)平衡實(shí)驗(yàn)、部分因子實(shí)驗(yàn)相比較，認(rèn)為Plackett-Burman法在篩選實(shí)驗(yàn)重要因子方面更為有效和準(zhǔn)確［5］，另外還具有數(shù)據(jù)處理簡單、可適用于任意多個(gè)實(shí)驗(yàn)因子等優(yōu)點(diǎn)。Box-Behnken設(shè)計(jì)是一種適用于2～5個(gè)因素的響應(yīng)面優(yōu)化方法，采用該法可以建立連續(xù)變量響應(yīng)面模型和回歸方程，同時(shí)可對(duì)影響因變量的各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，該法已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于各類培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)踐中［6-8］。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期從甘肅省天祝牧區(qū)牦牛乳酸奶中分離的產(chǎn)乳糖酶菌株Enterobacter sp.SYA2［9］為研究對(duì)象，對(duì)Enterobacter sp.SYA2 的發(fā)酵條件和產(chǎn)酶的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，以期為進(jìn)一步擴(kuò)大發(fā)酵實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Enterobacter sp.SYA2 本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)CGMCC No:5251;鄰硝基苯酚(ONP) 南京化學(xué)試劑有限公司，分析純;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal) 西安舟鼎國生物技術(shù)公司，色譜純;鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG) 科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，色譜純;種子培養(yǎng)基:乳糖10g/L、蛋白胨 10g/L、酵母膏 3g/L、NaCl 4g/L，p H6.5;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:乳糖 15g/L、蛋白胨 20g/L、酵母膏 3g/L、NaCl 4g/L、K2HPO41g/L，MnCl20.5g/L，pH6.5。

SW-CJH-1FD凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠;HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠;PB203-N電子天平 上海精密科學(xué)儀器廠;pHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠;SUPRA 22K低溫高速離心機(jī) 韓國HANSON技術(shù)公司;UV-2450紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;JY96-ПN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液制備 將活化好的菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在一定條件下培養(yǎng)后取發(fā)酵液20mL，4℃、6000r/min離心20min，收集菌體并用0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.5)洗滌兩次，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.5)至20mL，超聲破碎15min，4℃、12000r/min離心20min，上清液為粗酶液。

1.2.2 乳糖酶活力的測(cè)定 以O(shè)NPG為酶作用底物，參照文獻(xiàn)［10］并做適當(dāng)修改。標(biāo)準(zhǔn)曲線:取6個(gè)100mL 容量瓶，標(biāo)號(hào)為 1、2、3、4、5、6，分別移取 ONP儲(chǔ)備液 0.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0mL，各試管中加入25.0mL的Na2CO3溶液，再用磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，溶液 ONP的濃度分別是 0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mmol/L。以 1 號(hào)試管為空白管，于420nm處測(cè)定OD值。以O(shè)NP物質(zhì)的量濃度為橫坐標(biāo)，稀釋液的吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定:取0.5mL稀釋后的粗酶液，37℃下水浴5min，加入已預(yù)熱至37℃的含5mmol/L ONPG磷酸鹽緩沖液(pH6.5)1.5mL，37℃下水浴反應(yīng)10min，然后立即加入3.0mL 0.5mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，于420nm下測(cè)定OD值，測(cè)定3次取平均值?？瞻诪?.5mL加熱失活的酶液和1.5mL含5mmol/L ONPG磷酸鹽緩沖液(pH6.5)。一個(gè)酶活力單位定義(U)為:在37℃每分鐘水解釋放1μmolONP所需的酶量。

式中，X為乳糖酶活力(U/mL);C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的ONP的濃度(1μmol/mL);N為粗酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)酶活的影響 將菌種接種于種子培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h制備種子液，然后將種子液按體積分?jǐn)?shù)3%接種于裝液量為50mL/250mL三角瓶中，分別在 25、28、31、34、37、40℃下培養(yǎng) 24h，搖床轉(zhuǎn)速為175r/min，培養(yǎng)后收集菌體并測(cè)定酶活。

1.2.3.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酶活的影響 搖床轉(zhuǎn)速分別調(diào)節(jié)為 100、125、150、175、200、225r/min，其他條件不變，37℃振蕩培養(yǎng)24h后收集菌體處理后測(cè)定酶活。

1.2.3.3 裝液量對(duì)酶活的影響 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量分別為20、30、40、50、60mL，其他條件不變，搖床轉(zhuǎn)速150r/min、37℃振蕩培養(yǎng)24h后收集菌體處理并測(cè)定酶活。

1.2.3.4 種子接種量對(duì)酶活的影響 將種子液分別以1%、3%、5%、7%、9%、11%接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件不變，搖床轉(zhuǎn)速150r/min、37℃振蕩培養(yǎng)24h后收集菌體并處理并測(cè)定酶活。

1.2.3.5 種齡對(duì)酶活的影響 分別將培養(yǎng)6、8、10、12、14、16h的種子液以5%的接種量接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件不變，搖床轉(zhuǎn)速150r/min、37℃振蕩培養(yǎng)24h后收集菌體處理并測(cè)定酶活。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 以乳糖酶酶活為響應(yīng)值，在單因素基礎(chǔ)上采用兩步法進(jìn)行優(yōu)化:首先利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出對(duì)響應(yīng)目標(biāo)影響顯著的因素;然后利用Box-Benhnken設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)模型，最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4.1 重要因素篩選實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的6個(gè)組分乳糖、蛋白胨、酵母膏、NaCl、K2HPO4、MnCl2和pH進(jìn)行篩選。每個(gè)變量分別設(shè)定高低兩個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Level and code of variables for Plackett-Burman design

1.2.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出的對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響顯著的因素為實(shí)驗(yàn)因子，根據(jù)因素的正負(fù)效應(yīng)確定爬坡方向和變化步長，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體見表5。

1.2.4.3 Box-Benhnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析 以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選得到的對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響顯著的因素作為設(shè)計(jì)因子，以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得出的最佳濃度為中心點(diǎn)，應(yīng)用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 2 Main fermentation conditions and levels for Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)Enterobacter sp.SYA2產(chǎn)酶的影響

溫度是保證微生物生長和產(chǎn)酶的重要條件之一，它會(huì)影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)、菌株的代謝和生長速度等。

由圖1可以看出，在25～37℃的范圍內(nèi)，酶活隨著溫度升高逐漸升高，37℃時(shí)酶活達(dá)到最高，37℃以后酶活逐漸降低，所以Enterobacter sp.SYA2發(fā)酵的溫度應(yīng)控制在37℃左右。Hsu等人［11］研究表明，37℃為長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)CCRC15708最佳生長和產(chǎn)酶溫度。Batra［12］從喜馬偕爾邦的溫泉采樣分離出的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)RCS3，發(fā)酵溫度為50℃時(shí)，產(chǎn)酶能力最好。

圖1 溫度對(duì)Enterobacter sp.SYA2產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of temperature on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

2.1.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Enterobacter sp.SYA2酶活的影響

轉(zhuǎn)速提高溶氧，同時(shí)能促進(jìn)培養(yǎng)基中大分子物質(zhì)的分散，促進(jìn)菌體對(duì)其利用，降低高蛋白物質(zhì)的黏度對(duì)菌體生長的抑制作用［13-14］。由圖2可知，靜止培養(yǎng)時(shí)，菌體幾乎不生長，酶活為零;隨著轉(zhuǎn)速的升高，乳糖酶活不斷升高，當(dāng)超過150r/min后，乳糖酶活力逐漸下降。因此，該菌株發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速為150r/min。

圖2 轉(zhuǎn)速對(duì)Enterobacter sp.SYA2產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of rotation speed on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

2.1.3 裝液量對(duì)Enterobacter sp.SYA2酶活的影響 發(fā)酵時(shí)裝液量直接影響著培養(yǎng)基中溶解氧量，進(jìn)而影響產(chǎn)酶量。當(dāng)裝液量較低時(shí)，由于發(fā)酵液中溶氧量增加，從而抑制了微生物代謝;但當(dāng)裝液量過高時(shí)，溶氧量過低，不利于微生物生長代謝。250mL三角瓶中不同裝液量對(duì)乳糖酶活力的影響見圖3。結(jié)果顯示，當(dāng)250mL三角瓶中裝液量為50mL時(shí)，酶活力最高，為7.24U/mL。

2.1.4 接種量對(duì)Enterobacter sp.SYA2酶活的影響接種量過小，會(huì)增長延滯期，對(duì)培養(yǎng)不利。接種量過大，菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累過多，從而造成菌體過早的衰老，停滯期越短，培養(yǎng)基消耗快，不利于產(chǎn)物的合成［15］。

由圖4可以看出，隨著接種量的增加，酶活力逐漸上升，當(dāng)接種量為5%時(shí)，發(fā)酵液酶活為8.04U/mL，達(dá)到最大值，進(jìn)一步加大接種量，產(chǎn)酶水平呈下降趨勢(shì)。

2.1.5 菌齡對(duì)Enterobacter sp.SYA2酶活的影響 由圖5可知，種齡對(duì)乳糖酶活影響較大，隨著菌齡的增加，酶活先升高后降低，當(dāng)種子菌齡為8h時(shí)，酶活力最高，為9.02U/mL。

圖3 裝液量對(duì)Enterobacter sp.SYA2產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of liquid volume in flask on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

圖4 接種量對(duì)Enterobacter sp.SYA2產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of inoculum size on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

圖5 菌齡對(duì)Enterobacter sp.SYA2產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of cell age on production of Lactose from Enterobacter sp.SYA2

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 重要因素篩選實(shí)驗(yàn) Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見表4。

由表4可以看出，在α=0.05的顯著水平上，蛋白胨、乳糖、K2HPO43個(gè)因素對(duì)乳糖酶活的影響顯著，且影響均為正效應(yīng)，影響程度為:蛋白胨＞乳糖＞K2HPO4，對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化。其余4個(gè)因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的影響不顯著，NaCl為正效應(yīng)，在后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中取其高水平編碼對(duì)應(yīng)的濃度;酵母膏、MnCl2和培養(yǎng)基p H均為負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中取其低水平編碼對(duì)應(yīng)的濃度。

2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)，按一定的梯度增加蛋白胨、乳糖和K2HPO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman test design and results

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析Table 4 The analysis of results for Plackett-Burman design

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent path

由表5可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨、乳糖和K2HPO4濃度的增加，酶活先上升后下降，當(dāng)培養(yǎng)基中蛋白胨、乳糖和 K2HPO4的濃度分別為 25、30、3.0g/L時(shí)，所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液酶活最大，故以此條件作為Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理［16］，以乳糖酶活力為響應(yīng)值 Y，選取乳糖 X1、蛋白胨X2、K2HPO4X5三個(gè)因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用逐步回歸的方法進(jìn)行二次回歸分析，得到相應(yīng)的回歸方程式如下:

Y=15.81+0.45X1+0.49X2+0.49X5+0.17X1X2+0.51X1X5+0.22X2X5-1.20X12-1.41X22-1.62X52。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明:該方程回歸顯著，模型的R2值為0.9649，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小。由表7可以看出，方程中 X1、X2、X5、X1X5、X12、X22和X52對(duì)Y值的影響顯著，表明三個(gè)因素乳糖X1、蛋白胨X2、K2HPO4X3對(duì)酶活都有顯著影響，而且與響應(yīng)值間不是簡單的線性關(guān)系。

表6 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Experimental design and result of Box-Benhnken

表7 二次多項(xiàng)回歸模型方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 7 Significance test of regressive coefficient of regression equation

三個(gè)因素之間的交互作用情況見圖8～圖10。圖8為當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿课挥谥行乃綍r(shí)，乳糖濃度和K2HPO4濃度對(duì)發(fā)酵液酶活力影響的等高線圖，由圖可以直觀地看出乳糖濃度和K2HPO4濃度的交互作用較強(qiáng)。圖9為當(dāng)K2HPO4濃度位于中心水平時(shí)，乳糖濃度蛋白胨濃度對(duì)酶活力影響的等高線圖，由圖可以看出乳糖濃度和蛋白胨濃度交互作用不大。圖10為當(dāng)乳糖濃度位于中心水平時(shí)，蛋白胨濃度和K2HPO4濃度對(duì)酶活影響的等高線圖，由圖可以看出蛋白胨濃度和K2HPO4濃度的交互作用也不大。

采用Design-Expert軟件進(jìn)行嶺脊分析(Ridge Analysis)，得出乳糖酶活力最大估計(jì)值為15.96U/m L，此時(shí)因素X1、X2、X5對(duì)應(yīng)的實(shí)際濃度為:乳糖31.1g/L，蛋白胨26.0g/L，K2HPO43.0g/L。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)得的酶活平均值為15.95U/m L，與理論預(yù)測(cè)值基本一致，因此，基于響應(yīng)曲面法所得的乳糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

圖8 乳糖與K2 HPO4濃度交互作用等高線圖Fig.8 Contour plot for interaction effect between lactase and K2 HPO4 on production of lactose

圖9 乳糖與蛋白胨濃度交互作用等高線圖Fig.9 Contour plot for interaction effect between lactose and peptone on lactose production

圖10 蛋白胨與K2 HPO4濃度交互作用等高線圖Fig.10 Contour plot for interaction effect between peptone and K2 HPO4 on lactose production

3 結(jié)論

3.1 采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)Enterobacter sp.SYA2產(chǎn)乳糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度37℃，裝液量50mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速175r/min，接種量5%(V/V)，種齡8h。

3.2 在發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，首先通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)酶活影響顯著的3個(gè)因素即乳糖、蛋白胨、K2HPO4，然后以爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中心點(diǎn)，利用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化得出發(fā)酵培養(yǎng)基為:乳糖31.1g/L，蛋白胨26.0g/L，酵母膏 5.0g/L，K2HPO43.0g/L，NaCl 6.0g/L，MnCl20.5g/L，pH 6.5。利用該培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)得的酶活平均值為15.95U/mL，與理論預(yù)測(cè)值基本一致，證明了模型的可靠性。

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