微波輻射非熱效應(yīng)對A549細(xì)胞損傷反應(yīng)的研究

劉曉冬 徐 冶 王曉軍 孫璐陽 康 晶 曹慧玲

1.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林吉林 132011；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心，吉林吉林 132011

微波治療腫瘤主要是利用其熱效應(yīng)， 生物組織被微波輻照后，即吸收微波能，導(dǎo)致該區(qū)組織細(xì)胞內(nèi)的極性分子處于一種激勵狀態(tài)，發(fā)生高速振蕩，與鄰近分子頻頻磨擦而將微波能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，從而使組織凝固、壞死。 微波治療配合放、化療可增加放、化療的作用，從而減少它們的劑量，提高療效。 目前伴隨對微波研究的不斷深入，尤其是在醫(yī)療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用, 人們對微波治療腫瘤的機(jī)理有了新的認(rèn)識。 研究證實(shí)，一定強(qiáng)度的微波輻射是通過熱和(或)非熱效應(yīng)對機(jī)體造成損傷，所以微波治療腫瘤應(yīng)包含熱和(或)非熱效應(yīng)。 以往人們過多偏注于微波的熱效應(yīng)，至于非熱效應(yīng)的作用機(jī)制至今也不明確，尚無定論[1]。 實(shí)驗(yàn)室及離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果更是眾說紛紜，因此解開微波的“非熱效應(yīng)”之謎是當(dāng)前急待解決的任務(wù)之一。該研究以人肺癌A549 細(xì)胞為研究對象，探討了微波非熱效應(yīng)對組織細(xì)胞損傷的反應(yīng)及其作用機(jī)制，以期為微波治療腫瘤提供新的思考方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

微波輻射儀為南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司，MY8C-1 型微波功率源。 Cytochrome c、GRP 78、Cathepsin D 鼠單克隆抗體,Caspase-3、Caspase-4 兔多克隆抗體， 均購自美國Santa Cruz 公司。 單丹磺酰尸胺染料（monodansylcaolaverine，MDC）、多聚賴氨酸均購自美國Sigma 公司。 激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus FV1000）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549 細(xì)胞株由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室惠贈，細(xì)胞用含10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素的高糖完全培養(yǎng)基IMDM 培養(yǎng)基（Gibco,USA）在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。 取對數(shù)生長期細(xì)胞， 并調(diào)成2×105個／mL 接種于培養(yǎng)板，2～3 d 后細(xì)胞生長至70%融合用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及非熱效應(yīng)模型 將細(xì)胞培養(yǎng)板中A549 細(xì)胞按輻射強(qiáng)度分為: 100 W、150 W、200 W3 個實(shí)驗(yàn)組。 同時設(shè)立未輻射的空白對照組，處理方式為除不接受微波輻射外，其它均與輻射組相同。 輻射時將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于冰浴條件下，在輻射臺上依次進(jìn)行輻射，每組輻射時間均為10 min，輻射距離為10 cm。輻射后立即采用溫度計(jì)測定細(xì)胞培養(yǎng)物溫度沒有升高， 以確保非熱效應(yīng)模型的可靠性。 輻射后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后分別收集每實(shí)驗(yàn)組以及空白對照組的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.3 Western 印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白 將實(shí)驗(yàn)組（100 W、150 W、200 W） 及未輻射的陰性對照組細(xì)胞消化后收集于離心管，PBS清洗2 次，加入細(xì)胞裂解液冰上靜置15 min，10 000 g 離心15 min收集上清，得到樣品蛋白。 Bradford 法測定收集到的樣本的蛋白濃度，據(jù)此取等量蛋白。蛋白質(zhì)樣品與等量的2×SDS 凝膠加樣緩沖液混合均勻，煮沸變性，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白、然后轉(zhuǎn)膜并于室溫封閉，分別加入Cytochrome c、Caspase-3、GRP 78、Caspase-4、Cathepsin D 的一抗,4 ℃孵育過夜, 緩沖液洗膜4 次,每次15 min ,然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，洗膜后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑DAB，室溫顯色20 min，暗室中X 線片曝光。 β-actin 作為內(nèi)參照，天能凝膠成像儀分析系統(tǒng)（TANON 2500R 型）獲取圖像并進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 MDC 染色法檢測溶酶體功能變化 細(xì)胞以5×104鋪于24孔板，按實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞處理24 h 后：①PBS 洗2 遍，棄上清；②加入50 umol/L MDC 染液200 μL/孔，37 ℃溫育60 min； ③4%多聚甲醛500 μL/孔，固定15 min；④PBS 洗2 次，抗熒光淬滅劑封片。通過激光共聚焦顯微鏡 （Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）觀察細(xì)胞內(nèi)溶酶體的變化，并取圖拍照。

2 結(jié)果

2.1 非熱效應(yīng)對輻射細(xì)胞線粒體損傷

以β-actin 的吸光度值作為內(nèi)參照，對各組條帶的吸光度值進(jìn)行校正，進(jìn)行半定量分析。 與陰性對照組相比各輻射組細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)Cytochrome c 蛋白水平明顯上調(diào)，并隨著輻射劑量增加。同時與陰性對照組相比，輻射組細(xì)胞的Caspase-3 蛋白的活化形式即cleaved caspase-3 表達(dá)明顯增加，這兩種蛋白是細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白。 見圖1。

圖1 Western 印跡檢測Cytochrome、caspase-3 蛋白

2.2 非熱效應(yīng)對輻射細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷

Western 印跡檢測陰性對照組以及輻射組細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白78(GRP78)，結(jié)果輻射組細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)GRP78 蛋白水平明顯上調(diào)，并隨著輻射劑量增加。GRP78 蛋白在正常組織細(xì)胞中表達(dá)水平較低，但在低糖、低氧、酸中毒、細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)等應(yīng)激情況下，GRP78 蛋白表達(dá)水平顯著升高。 同時與陰性對照組相比，輻射組細(xì)胞的Caspase-4 蛋白活化，這兩種蛋白是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白。 見圖2。

圖2 Western 印跡檢測GRP78、caspase-4 蛋白

2.3 非熱效應(yīng)對輻射細(xì)胞溶酶體損傷

Western 印跡檢測結(jié)果顯示：與陰性對照組相比，微波輻射非熱效應(yīng)可以導(dǎo)致A549 細(xì)胞溶酶體蛋白水解酶Cathepsin D 表達(dá)增加（圖3），此結(jié)果表明微波輻射后的非熱效應(yīng)，可引起細(xì)胞溶酶體功能增強(qiáng)，釋放Cathepsin D 增多，并且是隨著輻射劑量而增加。Cathepsin D 是一種酸性溶酶體蛋白酶，在酸性環(huán)境中可溶解基底膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織，與侵襲性生物學(xué)行為有關(guān)。 同時MDC 染色后共聚焦顯微鏡觀察，顯示見實(shí)驗(yàn)組熒光明顯增強(qiáng)，表明微波輻射非熱效應(yīng)可以導(dǎo)致A549 內(nèi)的自噬情況增加，微波處理后的細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)了大量的自噬泡，并且是隨著輻射劑量而增加。 進(jìn)一步說明非熱效應(yīng)導(dǎo)致受損細(xì)胞利用溶酶體降解自身損傷的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)。 陰性對照組卻很少發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)自噬泡的生成。 見圖4。

圖3 Western 印跡檢測Cathepsin D 蛋白

圖4 MDC 染色共聚焦顯微鏡觀察溶酶體變化

3 討論

目前，伴隨微波的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制研究不斷深入，微波對生物體的非熱效應(yīng)引起了人們的極大關(guān)注。 非熱效應(yīng)是指熱效應(yīng)以外的微觀生物學(xué)效應(yīng)。 很多學(xué)者認(rèn)為，微波的非熱效應(yīng)主要作用機(jī)制是作為一種信號作用于細(xì)胞膜， 通過細(xì)胞信息傳導(dǎo)激活控制細(xì)胞代謝和生長的酶系統(tǒng)， 導(dǎo)致相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平、細(xì)胞因子、信號通路等的改變，影響細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)而影響細(xì)胞的功能。 但由于各種理論未能完全闡明 “非熱效應(yīng)”的作用機(jī)理，尤其是實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性也差，所以引起爭論。 該研究以A549 細(xì)胞為研究對象，建立微波輻射非熱效應(yīng)模型，驗(yàn)證“非熱效應(yīng)”的存在，并且認(rèn)為“熱效應(yīng)”對組織細(xì)胞所造成的損傷反應(yīng)可能是通過細(xì)胞線粒體、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體途徑共同所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

該研究顯示， 微波輻射非熱效應(yīng)致A549 細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Cytochrome c 蛋白水平明顯上調(diào)， 并隨著輻射劑量而增加。 Cytochrome c 在線粒體電子傳遞鏈中負(fù)責(zé)傳遞電子, 釋放增多可使線粒體產(chǎn)生更多超氧陰離子自由基和H2O2 以及活性氧。 活性氧的積累又將導(dǎo)致線粒體膨脹,內(nèi)膜非特異性孔道產(chǎn)生,細(xì)胞色素c 從內(nèi)膜脫落并釋放到胞質(zhì)中，加劇活性氧的產(chǎn)生,引起氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2]。 caspase-3 是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一， 多數(shù)誘發(fā)凋亡的信號都要經(jīng)過caspase 的介導(dǎo)，最終由caspase-3 執(zhí)行細(xì)胞 凋亡[3]。 cleaved caspase-3 是caspase-3 活化時經(jīng)剪切產(chǎn)生的活性片段，是有活性的caspase-3，其表達(dá)程度可反應(yīng)caspase-3 的活性狀態(tài)和細(xì)胞凋亡的大致情況。 該研究采用檢測cleaved caspase-3 的方法了解caspase-3 的激活狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻射組細(xì)胞的Caspase-3 蛋白明顯活化，認(rèn)為微波輻射非熱效應(yīng)對A549 細(xì)胞的線粒體造成一定的損傷，并啟動凋亡途徑。 微波輻射非熱效應(yīng)導(dǎo)致A549 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過抑制蛋白合成、促進(jìn)錯誤折疊蛋白降解等機(jī)制保護(hù)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的細(xì)胞。 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78 即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白，屬于熱休克蛋白70 家族成員，其在促進(jìn)蛋白加工、成熟以及維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。 多種擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的刺激均能夠誘導(dǎo)GRP78 表達(dá)[4-5]。 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)過程中，GRP78 的誘導(dǎo)表達(dá)對應(yīng)激細(xì)胞抵抗凋亡和恢復(fù)正常功能具有重要意義。 Caspase-4 是鼠類凋亡蛋白Caspase-12 的人類同源物，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)活化時被激活， 活化下游Caspase 蛋白激酶，caspase-12 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)調(diào)亡的關(guān)鍵分子[6-8]。該研究結(jié)果顯示輻射組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的GRP78 蛋白水平明顯上調(diào)， 并隨著輻射劑量增加，表明微波輻射非熱效應(yīng)對A549 細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)造成一定的損傷，并通過高表達(dá)GRP78 蛋白抵抗凋亡。 但是隨后Caspase-4 蛋白的表達(dá)增加表明損傷加重，分析認(rèn)為GRP78 與caspase12 交互作用共同調(diào)控著凋亡的發(fā)生。 具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究。 至于Cathepsin D 是溶酶體內(nèi)的天冬氨酰蛋白酶，在多種病理?xiàng)l件下可見其表達(dá)增加，與細(xì)胞溶酶體途徑凋亡密切相關(guān)[9]。 MDC 染色曾經(jīng)被作為自噬體的標(biāo)志，廣泛用于自噬檢測。 然而，目前的研究顯示MDC 是與細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡結(jié)合（溶酶體或自噬性溶酶體）而不是特異的結(jié)合自噬體。 該研究中隨著微波劑量的增加，Western 印跡檢測結(jié)果顯示， 溶酶體Cathepsin D 蛋白表達(dá)增高,通過共聚焦顯微鏡觀察MDC 染色明顯增強(qiáng)，提示微波輻射非熱效應(yīng)可以導(dǎo)致溶酶體途徑凋亡發(fā)生，并且微波輻射非熱效應(yīng)對A549 細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用呈現(xiàn)劑量依從性。

微波是300 MHz～300GHz 頻率范圍內(nèi)的非電離輻射， 伴隨著廣泛應(yīng)用于雷達(dá)、航空、通信工業(yè)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，人們曝露于微波輻射的機(jī)會越來越多， 微波輻射可能產(chǎn)生生物效應(yīng)及其對健康的影響已經(jīng)受到公眾以及研究人員的非常關(guān)注。 Omura 等人研究認(rèn)為環(huán)境中，例如彩電、計(jì)算機(jī)、微波爐、移動電話等產(chǎn)生的電磁場對人體的影響包括甚至是以“非熱效應(yīng)”為主。 而微波“非熱效應(yīng)”對生物體產(chǎn)生的影響是復(fù)雜的，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其生物學(xué)功效是多基因協(xié)同調(diào)控及蛋白表達(dá)所產(chǎn)生的作用， 這與該研究的結(jié)論是一致的，但具體分子機(jī)制還尚未闡明。 今后有關(guān)微波對腫瘤細(xì)胞的作用及其誘導(dǎo)凋亡不同途徑之間的關(guān)系的更深入研究，必將為充分、合理利用微波治療腫瘤提供新線索，同時也將為微波有效防護(hù)提供一定新的理論依據(jù)。

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