大鼠肝微粒體中鉤吻素子UPLC-MS／MS法測(cè)定與酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

李 彧，曾榮潔，鄭雪卿，郭陳建忠

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

鉤吻為馬錢科鉤吻屬植物鉤吻Gelsemium elegans（Gardn.et Champ.） Benth.全草，是世界聞名的劇毒植物，盛產(chǎn)于閩、粵、桂等地［1］?；瘜W(xué)成分研究表明：鉤吻含有生物堿、環(huán)烯醚萜、三萜及苯丙素類等化合物；其中吲哚類生物堿是其主要活性成分，也是其毒性成分，目前共有將近70種生物堿從該植物中被分離得到［2-6］。藥理實(shí)驗(yàn)表明：鉤吻總生物堿具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，但是治療量卻與中毒量較接近［7］，因此大大限制了臨床的廣泛應(yīng)用。同時(shí)鉤吻還具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用［8］。鉤吻素子是從鉤吻中分離得到的一種Koumine型吲哚類生物堿，具有多種生理藥理活性，如抗炎，鎮(zhèn)痛，抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫功能，治療銀屑病以及抗血小板聚集作用等［9-11］。然而有關(guān)鉤吻素子的體內(nèi)外代謝與藥動(dòng)學(xué)研究尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)鉤吻素子在大鼠肝微粒體中孵化反應(yīng)后鉤吻素子的剩余量來研究它的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，尋找最優(yōu)孵化體系，為該化合物的代謝酶譜鑒定提供前提條件，同時(shí)也為進(jìn)行該藥材的毒性與代謝相關(guān)性研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC-MS／MS超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters，Milford，USA）；HCG-24A氮吹儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；H2050R-1臺(tái)式高效冷凍離心機(jī)（湖南湘儀公司）；DAIHAN／VM-10渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器公司）；FA1004精密電子天平（上海衡平儀器儀表廠）。

1.2 試藥 鉤吻素子（上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心提供，批號(hào)：20120227）；鉤吻堿甲（上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心提供，批號(hào)：20120227）；氯化鎂（MgCl2）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20111220）；葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）（Sigma 公司，批號(hào) MECD0015 0940），葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）（上海聚生源生物科技有限公司，批號(hào)：111027）；氧化型輔酶Ⅱ（NADP＋）（上海聚生源生物科技有限公司，批號(hào)：120117）；Wistar大鼠肝微粒體由上海瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司提供，批號(hào)：BDVH；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水，其余藥品和溶劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 鉤吻素子溶液的配制 精密稱定鉤吻素子對(duì)照品適量，溶于甲醇溶液中，配成100 mM的母液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫R用前稀釋成所需濃度。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱定鉤吻堿甲適量，溶于甲醇，配成10 μg／mL的內(nèi)標(biāo)溶液，存放在4℃冰箱中備用。

2.1.3 空白溫孵液 大鼠肝微粒體經(jīng)過100℃高溫滅活，用磷酸鹽緩沖液稀釋成蛋白濃度為0.5 mg／mL的空白溫孵液。

2.2 孵育體系及樣品處理 溫孵體系包括肝微粒體（1.0 mg／mL）、G-6-P（10 mM）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（1 U／mL）、MgCl2（4 mM）、磷酸鹽緩沖液（100 mM）、底物（相應(yīng)濃度）和 NADP＋（1 mM），總體積為200 μL。反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑的濃度均小于0.5%，反應(yīng)從加入輔助因子NADP＋開始，37℃振蕩水浴孵育30 min后，加入冰冷甲醇397 μL和內(nèi)標(biāo)液3 μL，冰浴終止反應(yīng)，20 000×g離心10 min，吸取上清液550 μL，在 60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?200 μL 20%甲醇溶液重組復(fù)溶，再20 000×g離心10 min，吸取上清液，進(jìn)行分析。

2.3 色譜方法與質(zhì)譜條件

2.3.1 液相色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，USA）；柱溫為40℃；流速為0.3 mL／min；流動(dòng)相采用含0.1%甲酸的甲醇溶液（A）－0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（時(shí)間 ／A%）：0／20，1／35，4／35，5／60，6／70，7／20；進(jìn)樣體積為 1 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 MS采用正離子、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式監(jiān)測(cè)，離子監(jiān)控通道m(xù)／z 307.1＞69.76（鉤吻素子），m／z 323.1＞69.76（鉤吻堿甲，內(nèi)標(biāo)）；毛細(xì)管電壓2.8 kV，錐孔電壓35 V，離子源溫度110℃，脫溶劑溫度 300℃，錐孔氣（N2）流速 50 L／h，脫溶劑氣（N2）流速 450 L／h。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取空白溫孵液和肝微粒體溫孵樣品（加入 20 μM 鉤吻素子），按“2.2”項(xiàng)下操作方法處理后測(cè)定，見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明空白溫孵液中無內(nèi)源性物質(zhì)干擾目標(biāo)分析物的檢測(cè)。

2.4.2 線性關(guān)系 精密量取適量鉤吻素子對(duì)照品母液，再用甲醇稀釋成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)液，加入空白溫孵液，其余的實(shí)驗(yàn)步驟按“2.2”項(xiàng)下操作方法處理測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積比值為縱坐標(biāo)作線性回歸，計(jì)算得回歸方程y＝0.1544x＋0.0593（r＝0.9939，n＝5）。結(jié)果表明： 鉤吻素子在 0.5～30 μM濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度 在空白孵育液中加入不同濃度的鉤吻素子溶液，配置成0.5、5和30 μM的低、中、高3種濃度QC樣品溶液，各6份，按照“2.2”項(xiàng)操作方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5 d。計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表1。

表1 鉤吻素子精密度和準(zhǔn)確度

2.5 酶促動(dòng)力學(xué)研究

2.5.1 溫孵時(shí)間的影響 溫孵體系中底物鉤吻素子的濃度為30 μM，肝微粒體蛋白濃度為1.0 mg／mL，37℃溫孵， 分別于 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min取樣，處理后進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明：鉤吻素子在0～30 min呈線性減少，30～100 min鉤吻素子的剩余量不再發(fā)生變化，因此反應(yīng)30 min為最佳溫孵時(shí)間。

2.5.2 蛋白濃度的影響 孵化體系中鉤吻素子的濃度為30 μM，大鼠肝微粒體蛋白濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0 mg／mL，溫孵 30 min，處理后測(cè)定。結(jié)果表明：鉤吻素子的剩余量在0.25～1.0 mg／mL呈線性減少，在1.0～2.0 mg／mL鉤吻素子的剩余量幾乎不再變化，說明酶已接近飽和狀態(tài)。因此選擇1.0 mg／mL為最佳蛋白濃度。

2.5.3 酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 鉤吻素子選用濃度為 2、5、10、20 和 30 μM 的體系濃度（S），肝微粒體蛋白濃度 1.0 mg／mL，37℃孵育 30 min，其它步驟同“2.2”項(xiàng)下樣品處理方法。以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鉤吻素子的剩余量，進(jìn)而求得減少速率（V）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Linewearve-Burk雙倒數(shù)作圖法，以V-1對(duì)S-1作圖，得到直線，其縱截距為Vmax-1，橫截距為Km-1進(jìn)行計(jì)算，代謝清除率為Vmax／Km。鉤吻素子的回歸方程為 Y＝0.0468X＋0.0033，r＝0.9899（見圖 2），計(jì)算得鉤吻素子的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為14.2 μmol／L，Vmax為 303.03 pmol／（min·mg·pro） 以及肝清除率CLint（Vmax／Km）為 21.37 μL ／（min·mg·pro）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)利用三重四級(jí)桿超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀中其質(zhì)譜技術(shù)的多通道監(jiān)測(cè)功能和超高效液相色譜技術(shù)的卓越分離能力，使UPLC-MS／MS技術(shù)對(duì)檢測(cè)樣品的時(shí)間和成本大大下降。該技術(shù)有較好選擇性和較高靈敏度，有利于實(shí)驗(yàn)的定量測(cè)定。

圖2 鉤吻素子1／V隨1／S變化曲線

肝臟CYP450酶主要存在于肝微粒體中，是動(dòng)物體中參與外源性物質(zhì)代謝的主要酶系，有種屬性差異。本實(shí)驗(yàn)采用NADP＋還原系統(tǒng)啟動(dòng)酶促反應(yīng)，過模擬體內(nèi)環(huán)境，研究鉤吻素子的酶促反應(yīng)動(dòng)力。依據(jù)鉤吻素子的剩余量隨底物濃度及溫孵時(shí)間的變化，找到了最佳溫孵條件。結(jié)果表明：Wistar大鼠肝微粒體中的細(xì)胞色素P450酶參與了鉤吻素子的生物轉(zhuǎn)化。課題組其他成員前期采用SD大鼠肝微粒和HPLC法研究鉤吻素子的代謝，并未發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物，這可能與采用的HPLC法靈敏度不足有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步開展鉤吻生物堿的不同種屬動(dòng)物毒性差異與代謝相關(guān)性研究奠定了基礎(chǔ)。鉤吻素子是中草藥鉤吻中的主要活性與毒性成分之一，通過單一成分在肝微粒體中的代謝研究，為闡明其在體內(nèi)的代謝機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

［1］陳毅勝，鄭碩.中國有毒植物［M］.北京：科學(xué)出版社，1987：371-376.

［2］DUTT V，THAKUR S，DHAR V J，et al.The genus Gelsemium：An update［J］.Pharmacogn Rev，2010，4（8）：185-194.

［3］ZHANG B，ZHANG Q P，LIU H，et al.Iridoids from leaves of Gelsemium elegans［J］.Phytochemistry，2011，72（9）：916-922.

［4］張彬鋒，侴桂新，王崢濤.鉤吻非生物堿類化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2009，34（18）：2334-2337.

［6］ZHANG Z，DI Y T，WANG Y H，et al.Gelegamines A-E：five new oxindole alkaloids from Gelsemium elegans［J］.Tetraedron，2009，65（23）：4551-4556.

［7］RUJJANAWATE C，KANJANAPOTHI D，PANTHONG A，et al.Pharmacological effect and toxicity of alkaloids from Gelsemium elegans Benth.［J］.Journal of Ethnopharmacology，2003，89（1）：91-95.

［8］劉浩，俞昌喜.鉤吻的研究進(jìn)展［J］.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，42（5）：469-472.

［9］XU Y，QIU H Q，LIU H，et al.Effects of koumine，an alkaloid of Gelsemium elegans Benth.，on inflammatory and neuropathic pain models and possible mechanism with allopregnanolone［J］.2012，101（3）：504-514.

［10］張楨，劉光明，何紅平.鉤吻吲哚生物堿類化合物研究進(jìn)展［J］.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，7（6）：10-12.

［11］黃靜，蘇燕評(píng)，俞昌喜，等.鉤吻生物堿化合物體外抗消化系統(tǒng)腫瘤的活性［J］.海峽藥學(xué)，2010，22（3）：197-200.