敗醬草乙醇提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2凋亡與增殖的影響

黃 煒，楊 斌，陳 陽，黃 琰，張 偉，楊 芳，陳婷婷

（福州市中醫(yī)院，福建 福州 350001）

結(jié)、直腸癌是一類常見的惡性腫瘤，目前全球每年新增發(fā)病例數(shù)高達(dá)120萬，每年近60萬人死于大腸癌；其發(fā)病率和死亡率在全部惡性腫瘤中居第3位［1］。手術(shù)、化療、放療仍然是目前常用的3種主要治療方式。雖然手術(shù)被認(rèn)為是目前該病的主要治療手段，但仍有50%患者接受手術(shù)治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)［2］。對(duì)于術(shù)后復(fù)發(fā)及失去手術(shù)機(jī)會(huì)或轉(zhuǎn)移性大腸癌患者，化療則是主要的治療手段。盡管5-Fu、順鉑、依立替康等化療藥物的不斷發(fā)展和聯(lián)合在臨床上廣泛應(yīng)用在一定程度上提高了患者對(duì)化療的反應(yīng)率，然而大腸癌的化療療效并沒有出現(xiàn)顯著改善，其中位生存期仍僅為20～28個(gè)月［3］。這使得臨床療效確切、毒副作用少的中藥復(fù)方逐漸受到國內(nèi)外研究者的重視［4-5］。

敗醬草（Patrinia scabiosaefolia，PS）為敗醬科植物白花敗醬草（Patrina villosaJuss，PVJ）和黃花敗醬（Patrinia scabiosaefolia Fisch.ex Trev）的全草，味辛、苦，微寒；歸肝、胃、大腸經(jīng)；具有清熱解毒、消腫排膿和祛瘀止痛之功效，廣泛用于腸癰、腸炎、痢疾及消化道腫瘤等［6］。民間常用于對(duì)結(jié)腸癌的治療，但其作用機(jī)理尚不完全清楚。因此我們進(jìn)行了黃花敗醬草對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2增殖與凋亡的影響及其作用機(jī)制研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材和細(xì)胞株 黃花敗醬草購于自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂（批號(hào)：101117）；Caco-2購于中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（trypsin），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、Trizol，lifetechnology公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）干粉，DAPI染色液，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Mix，Thermo公司；引物自行設(shè)計(jì)并由上海生工生物有限公司合成。

1.3 儀器 RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DLSB-520低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；B-290型實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī)，瑞士Buchi；二氧化碳培養(yǎng)箱，HF212UV，Heal Force；熒光倒置顯微鏡，德國Leica公司；ELX800酶標(biāo)儀，BioTek公司；PCR儀，Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、APC 300型電泳儀、水平式電泳槽，美國Bio-Rad公司；5417R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 敗醬草醇提物（EEPS）的制備 敗醬草全草，加入8倍量的80%乙醇（8 L）加熱回流提取2次，每次1 h。2次提取液過濾，濾液減壓濃縮（50℃，0.01 MPa）至相對(duì)密度1.10，噴霧干燥（進(jìn)出口溫度140℃／80℃；）得干粉。稱量適量提取物用50%DMSO和50%水溶解，配制成250 mg／mL的儲(chǔ)存溶液，經(jīng)震蕩和超聲后4℃保存?zhèn)溆?，使用前用完全培養(yǎng)基稀釋成所需的濃度并過濾。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）、100 U／L 青霉素和 100 mg／L 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并放置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待匯合率長至80%～90%傳代。

2.3 MTT法測(cè)定敗醬草對(duì)細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長期的Caco-2，至80%～90%匯合時(shí)用0.25%胰酶消化后，離心收集細(xì)胞。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并配制成細(xì)胞密度為5×104個(gè)／mL細(xì)胞懸液，均勻接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。設(shè)空白對(duì)照組（直接加入等體積培養(yǎng)基）和EEPS治療組（終濃度分別為0.5、1、2 mg／mL），以上各組均設(shè) 8 個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去各孔培養(yǎng)基，每孔各加入0.5 mg／mL的MTT溶液100 μL，繼續(xù)在37℃條件下孵育4 h，吸去各孔MTT溶液，并在每孔中加入DMSO 100 μL，放振蕩器上震蕩使結(jié)晶充分溶解，于ELX800酶標(biāo)儀在570 nm下檢測(cè)各組吸光度值（即OD值），并按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 Caco-2細(xì)胞用EEPS藥物干預(yù)24 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

2.5 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 對(duì)數(shù)生長的Caco-2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，取每孔1×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于12孔板中，過夜后分別用不同濃度EEPS藥物干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，PBS輕洗3遍，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫放置10 min。棄甲醛，PBS輕洗 3遍，加入 DAPI溶液 1 mL／孔，避光，37℃孵育20 min。染色后棄DAPI溶液，PBS輕洗3遍，除去多余的DAPI染色液。用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化并拍照。

2.6 RT-PCR檢測(cè)Bc1-2和Bax的mRNA表達(dá)Caco-2細(xì)胞胰酶消化后，取2×105個(gè)細(xì)胞每孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)過夜后用不同濃度的EEPS干預(yù)24 h，培養(yǎng)板中細(xì)胞經(jīng)PBS洗凈后參照Trizol試劑說明書用Trizol法提取總RNA，經(jīng)濃度測(cè)量后，取總RNA純度符合實(shí)驗(yàn)要求（OD260／OD280在1.8～2.1之間）后樣本的總RNA 1 μg，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（20 μL體系）：cDNA 1 μL，Mix 10 μL，上下游引物各 1 μL，加DEPC水補(bǔ)齊至20 μL，震蕩混勻和離心后，置PCR儀中擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后進(jìn)行光密度掃描，以GAPDH基因的表達(dá)為內(nèi)參，根據(jù)條帶的明暗和大小判斷相關(guān)基因的表達(dá)量。具體的退火溫度及引物序列見表1。

表1 PCR引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，并用表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA分析），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

3 結(jié) 果

3.1 EEPS抑制Caco-2細(xì)胞增殖 見圖1。

3.2 EEPS對(duì)Caco-2細(xì)胞形態(tài)的影響 見圖2。

圖2 不同濃度的EEPS對(duì)Caco-2細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組Caco-2細(xì)胞核仁清楚，胞質(zhì)均勻，生長良好，形成貼壁的近圓形細(xì)胞。隨著EEPS濃度的增加，可見細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞變小變圓，甚至部分出現(xiàn)皺縮等形態(tài)改變，當(dāng)濃度為2 mg／mL時(shí)，細(xì)胞數(shù)明顯減少，甚至死亡而懸浮、脫落。該結(jié)果顯示敗醬草醇提物能抑制Caco-2細(xì)胞的增殖和改變細(xì)胞形態(tài)的作用。

3.3 EEPS對(duì)Caco-2細(xì)胞凋亡的影響 見圖3。

圖3 不同濃度的EEPS對(duì)Caco-2細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下觀察，可見空白對(duì)照組Caco-2細(xì)胞胞核完整，染色質(zhì)均勻。在高濃度EEPS作用下，染色質(zhì)固縮，呈現(xiàn)出高亮狀態(tài)。

3.4 EEPS對(duì)Caco-2細(xì)胞Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)的影響 見圖4。

圖4 不同濃度EEPS干預(yù)后Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá)

Caco-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度EEPS藥物干預(yù)24 h后，觀察可得EEPS能明顯地下調(diào)Bcl-2及上調(diào)Bax的mRNA表達(dá)，并且呈明顯的量效作用。

4 討 論

外科手術(shù)為主的綜合治療仍是結(jié)腸癌的首選治療方式，但患者5年生存率仍然不高［7］。氟尿嘧啶等化療藥物仍是目前臨床常用藥物，但這些藥物缺乏疾病的特異性，取得療效的同時(shí)也往往給患者帶來較大的毒副作用。因此，具有毒副作用小的中藥日益受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和認(rèn)可。

4.1 細(xì)胞過度增殖與細(xì)胞凋亡失調(diào)是腫瘤發(fā)生的主要原因。細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的主動(dòng)、高度有序的死亡過程［8］。因此抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡一直是抗腫瘤研究的主要內(nèi)容之一。其中Bcl-2家族是目前研究較為廣泛和深入的一類基因。Bcl-2蛋白家族是調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因子，包括Bcl-2為代表的抗凋亡基因和Bax為凋亡的促凋亡基因，且目前研究表明白花蛇舌草、半枝蓮等清熱解毒類中藥具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用，且部分機(jī)制研究顯示通過抑制Bcl-2的表達(dá)和上調(diào)Bax的表達(dá)可能是其內(nèi)在機(jī)制［9-10］。

4.2 敗醬草具有清熱解毒、活血化瘀等功效。廣泛應(yīng)用于大腸癌等多種腫瘤的治療，并在消化、呼吸、血液等惡性腫瘤治療中取得較好的療效?，F(xiàn)代研究表明，其主要化學(xué)成分有熊果酸、免疫多糖、烏索酸、敗醬草素等，這些有效成分具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗腫瘤的活性［11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EEPS作用后，MTT法檢測(cè)顯示隨著敗醬草乙醇提取物劑量的增加，對(duì)Caco-2細(xì)胞的抑制作用也相應(yīng)增強(qiáng)；在倒置顯微鏡下觀察到隨藥物濃度的增加，細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞形態(tài)皺縮，甚至脫落而浮懸于培養(yǎng)液中；EEPS對(duì)能夠明顯下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表達(dá)，且明顯上調(diào)Bax的mRNA表達(dá)，具有顯著的量效關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)表明：敗醬草醇提物可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，且通過抑制Bcl-2的表達(dá)和促進(jìn)Bax的表達(dá)可能是其內(nèi)在機(jī)制。但本實(shí)驗(yàn)所用藥物為提取物，發(fā)揮重要作用的成分尚不十分清楚，深層次抗腫瘤作用及機(jī)制研究和仍需進(jìn)一步結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有待進(jìn)一步深入研究。

［1］JEMAL A，BRAY F，CENTER M M，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［2］FANG Y J，LU Z H，WANG G Q，et al.Elevated expressions of MMP7，TROP2，and survivin are associated with survival，disease recurrence，and liver metastasis of colon cancer［J］.Int J Colorectal Dis，2009，24（8）：875-884.

［3］MONTAGNANI F，CHIRIATTI A，TURRISI G，et al.A systematic review of FOLFOXIRI chemotherapy for the first-line treatment of metastatic colorectal cancer：improved efficacy at the cost of increased toxicity［J］.Colorectal Dis，2011，13（8）：846-852.

［4］GORDALIZA M.Natural products as leads to anticancer drugs［J］.Clin Transl Oncol，2007，9（12）：767-776.

［5］JI H F，LI X J，ZHANG H Y.Natural products and drug discovery.Can thousands of years of ancient medical knowledge lead us to new and powerful drug combinations in the fight against cancer and dementia?［J］.EMBO reports，2009，10（3）：194-200.

［6］高學(xué)敏.中藥學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2002：140-142.

［7］PETO J.Cancer epidemiology in the last century and the next decade［J］.Nature，2001，411（6835）：390-395.

［8］許守明，陳雙喜，何艷霞.細(xì)胞凋亡與細(xì)胞色素C［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15（15）：38-39.

［9］彭軍，林久茂，魏麗慧，等.白花蛇舌草提取物對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞bcl-2和 bax表達(dá)的影響［J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，20（5）：23-26.

［10］彭軍，林久茂，魏麗慧，等.半枝蓮提取物誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，20（6）：35-39.

［11］單保恩，張金艷，杜肖娜，等.白花蛇舌草的免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21（5）：370-374.