發(fā)酵及新鮮葡萄籽與相關(guān)保健品中原花青素檢測(cè)方法的比較

李應(yīng)麗，王學(xué)清，楊迎春，楊 潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

葡萄為世界范圍內(nèi)普遍栽培的水果之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)21世紀(jì)全世界年產(chǎn)葡萄約6.5×107t，我國(guó)年產(chǎn)葡萄約105t，80%～90%的葡萄用于釀酒和果汁飲料加工。葡萄籽作為兩者加工的下腳料約占鮮果重量的4%～7%，這樣我國(guó)每年就有4000～6000t的副產(chǎn)品——葡萄籽[1]。目前，國(guó)際市場(chǎng)上備受關(guān)注的葡萄籽提取物（GSE）是從釀酒葡萄的種子中提取出來(lái)的一種多酚混合物，其多酚含量多在95%以上[2]。原花青素是植物界廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，是由不同含量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成，具有水溶、無(wú)毒、無(wú)過(guò)敏、安全性好等特性，是一種天然的自由基清除劑和抗氧化劑，具有抗衰老、抗腫瘤、抗癌變、預(yù)防心腦血管疾病、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等功能[3-4]。葡萄多酚主要存在于葡萄皮與葡萄籽中，研究表明，葡萄的果皮中多酚含量可達(dá)25%～50%，種籽中則可達(dá)50%～70%[5]。原花青素主要由黃烷醇中的單體兒茶素、表兒茶素、兒茶素沒(méi)食子酸酯和表兒茶素沒(méi)食子酸酯聚合而成。而葡萄籽中原花青素主要由兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯及其二聚、三聚……最高平均聚合度達(dá)十五聚體組成[6]。通常將二-四聚體稱為低聚體（OPC），將五聚體以上的稱為高聚體（PPC）[7]。原花青素單體按不同聚合度形成聚合體，因構(gòu)象或鍵合位置不同，單體又有多種異構(gòu)體，要測(cè)定每一成分的含量極為困難。目前國(guó)際上還沒(méi)有統(tǒng)一的原花青素檢測(cè)方法，其定量分析常用紫外分光光度法，包括正丁醇-鹽酸法、鐵鹽催化比色法、香草醛-鹽酸／硫酸、Folin-Ciocalteau法（福林-肖卡法）及高鐵鹽-鐵氰化鉀分光光度法、鉬酸銨分光光度法。此外，還可以采用高效液相色譜法及HPLC-MS聯(lián)用測(cè)定原花青素含量[8]。本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法中的硫酸香草醛法和福林-肖卡法測(cè)定不同的葡萄籽提取物及國(guó)內(nèi)和澳大利亞原花青素保健品中的原花青素含量，比較兩種方法在測(cè)定結(jié)果方面的差異；并用高效液相色譜法定性分析葡萄籽提取物與市售原花青素保健品的特征峰是否一致，為同類型保健品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄籽渣 2011年10月購(gòu)于中信國(guó)安葡萄酒業(yè)有限公司，發(fā)酵紅葡萄酒后籽渣，葡萄品種為赤霞珠；新鮮葡萄籽 購(gòu)于烏魯木齊市場(chǎng)的新鮮葡萄，實(shí)驗(yàn)室自取葡萄籽；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥95%） 購(gòu)自成都曼思特公司；兒茶素（HPLC≥98%）、表兒茶素（HPLC≥98%） 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所；沒(méi)食子酸（含量≥99%）；原花青素保健品 澳大利亞市場(chǎng)上購(gòu)買的7種原花青素保健品，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上購(gòu)買的天津尖峰原花青素（原花青素含量≥95%）及安陽(yáng)晶森原花青素；甲酸 色譜純；甲醛、濃硫酸、香草醛、福林酚試劑乙等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。以上樣品列表如表1。

高效液相色譜儀（LC-10ATvp） 配備紫外檢測(cè)器（SPD-10Avp）和脫氣裝置（DGU-12A），日本島津公司；AG204型分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Spectrumlab 53紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司。

表1 葡萄籽及市售保健品編號(hào)及來(lái)源Table 1 The numbers and source of grape seeds and merchant health products

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 分別稱取樣品PT1～PT112.0g，Y1～Y71.0g，以70%乙醇，料液比為1∶6，50℃恒溫提取2h，上清液干過(guò)濾后分別定容于25mL及10mL容量瓶（PT1～PT11定容至25mL，Y1～Y7定容至10mL），避光放置待測(cè)。

1.2.2 硫酸香草醛法[9]

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 0.5mg/mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.025g尖峰（原花青素含量≥95%），用70%乙醇溶解并定容至50mL。配成溶液濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。分別取上述不同濃度的溶液0.5mL于10mL比色管中，然后依次加入2.5mL 30g/L香草醛和2.5mL 30%硫酸，30℃避光反應(yīng)20min，于500nm下測(cè)其吸光值，以原花青素含量（mg/g）對(duì)吸光值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品中原花青素含量測(cè)定 取1.2.1中處理好的樣品0.5mL于10mL比色管中，依次分別加入2.5mL 30g/L香草醛和2.5mL 30%硫酸，30℃避光反應(yīng)20min，于500nm下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素含量（以原花青素計(jì)）。

1.2.3 福林-肖卡法[10]

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 1mg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取沒(méi)食子酸0.010g，用蒸餾水溶解定容至100mL。分別吸取標(biāo)樣溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于10mL比色管中，依次加入0.2mol/L福林-肖卡試劑1.0mL，各管依次加入6mL左右的蒸餾水和1.5mL20%碳酸鈉溶液，以蒸餾水定容至10mL。40℃顯色2h，于760nm下測(cè)定吸光值，以沒(méi)食子酸含量（mg/g）對(duì)吸光值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 樣品原花青素含量測(cè)定 取1.2.1中處理的樣品0.5mL于10mL比色管中，依次加入0.2mol/L福林-肖卡試劑1.0mL，各管依次加入6mL左右的蒸餾水和1.5mL20%碳酸鈉溶液，以蒸餾水定容至10mL。40℃顯色2h后，于760nm下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素含量（以沒(méi)食子酸計(jì)）。

1.2.4 高效液相色譜分析[11]原花青素、兒茶素和表兒茶素標(biāo)品及樣品的HPLC條件：色譜柱Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為A（甲醇）和B（水），進(jìn)樣量25μL，柱溫25℃，流速0.8mL/min，梯度洗脫：0～3min 100%A；～15min 90%A+10%B；～35min 75%A+25%B；～55min 65%A+35%B；～65min 50%A+50%B；～75min 40%A+60%B；～85min 20%A+80%B；～80min 100%B；～100min 90%A+10%B。檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，SPD-10Avp紫外檢測(cè)器。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸香草醛法和福林-肖卡法測(cè)定原花青素含量對(duì)比

葡萄籽各樣品中原花青素含量測(cè)定結(jié)果如圖1。可看出，PT6～PT11即以新鮮葡萄籽為原料提取的原花青素含量明顯高于以發(fā)酵紅葡萄酒后籽渣為原料提取的原花青素，不同品種的新鮮葡萄籽中原花青素含量也有所不相同。但發(fā)酵紅葡萄酒后的葡萄籽渣原料中，由于發(fā)酵后未蒸餾的PT1中含有葡萄皮，其原花青素含量低于只含有葡萄籽的PT2、PT3；且PT2、PT3中原花青素含量無(wú)顯著性差異，即曬干與否對(duì)其含量影響不大，這與玫瑰香品種（即PT10、PT11）的葡萄籽結(jié)果一致。

圖1 兩種方法測(cè)定葡萄籽各樣品中原花青素的含量Fig.1 The procyanidine content of grape seeds each sample with two assay methods

圖2 兩種方法測(cè)定國(guó)內(nèi)外保健品中原花青素含量Fig.2 The procyanidine content of health products at home and abroad with two assay methods

圖2中顯示在原花青素含量以沒(méi)食子酸計(jì)時(shí)，各樣品之間無(wú)顯著性差異，而以原花青素計(jì)時(shí)，Y6、Y7的原花青素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他幾種樣品。不論以原花青素計(jì)還是以沒(méi)食子酸計(jì)，國(guó)內(nèi)的尖峰與安陽(yáng)和澳大利亞原花青素保健品中原花青素含量都不低于45mg/g。澳大利亞市售的7種保健品中原花青素含量為葡萄籽原料的50～100倍，但含量差別較大，其中Y6含量最高，為154mg/g。而國(guó)內(nèi)的尖峰與安陽(yáng)原花青素含量分別與Y2、Y3相近，并高于Y1、Y4、Y5。

圖1、圖2綜合比較，相同樣品用福林-肖卡法方法測(cè)得的原花青素含量低于用硫酸香草醛法測(cè)得的原花青素含量。但兩種方法均測(cè)得Y6中原花青素含量最高。說(shuō)明采用不同的方法測(cè)定原花青素含量時(shí)由于原理不同，測(cè)定的結(jié)果也不盡相同，但含量高低趨勢(shì)是一致的。

2.2 高效液相色譜分析

由圖3A、B、C可看出，成都曼思特原花青素標(biāo)準(zhǔn)品中含有兒茶素及表兒茶素，但是由于沒(méi)有多聚體的標(biāo)準(zhǔn)品，大量組分不能確定。但可以找出特征峰，為原花青素類商品提供參考依據(jù)。圖3D即為國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上原花青素提取物的液相圖譜，因?yàn)槿芤簼舛炔煌?，圖中峰高不同，但安陽(yáng)及尖峰原花青素與成都曼斯特原花青素標(biāo)準(zhǔn)品有較高相似度，說(shuō)明二者的產(chǎn)品純度較高。由圖4A可看出澳大利亞原花青素保健品Y1～Y7有較多相似的峰型，與圖3D中三種原花青素明顯的不同是在45～55min處有一個(gè)較大的未分開(kāi)的峰，其中以Y6最為明顯。其中Y6樣品在35min和70～80min處有較大且未分開(kāi)的峰，該峰在圖3D中各原花青素標(biāo)準(zhǔn)品及圖4A的其他幾種保健品中不存在，且Y6原花青素含量在用硫酸香草醛法及福林—肖卡法測(cè)定結(jié)果中含量均是最高的，可能與這兩處峰的存在有關(guān)。圖4B顯示PT1（發(fā)酵紅葡萄酒后未經(jīng)蒸餾的紅籽）的高效液相圖與成都曼思特原花青素標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖最相近，且在45～55min處擁有和澳大利亞原花青素保健品相同的未分開(kāi)的峰。PT5（蒸餾后酒精）在用硫酸香草醛法及福林—肖卡法測(cè)定時(shí)未檢測(cè)到，但在液相圖譜中可以檢測(cè)到，應(yīng)該與檢出限不同有關(guān)。

圖3 HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms

圖4 HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatograms

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)用硫酸香草醛法和福林-肖卡法對(duì)發(fā)酵紅葡萄酒后的各種葡萄籽、新鮮葡萄籽及國(guó)內(nèi)和澳大利亞市售的原花青素保健品進(jìn)行了原花青素含量測(cè)定。對(duì)比結(jié)果顯示：兩種方法測(cè)得的原花青素含量不同，但各種葡萄籽樣品中，新鮮曬干的葡萄籽原花青素含量高于發(fā)酵紅葡萄酒后的葡萄籽；國(guó)內(nèi)外市售原花青素保健品中原花青素含量約為葡萄籽的50～100倍。兩種方法都測(cè)出發(fā)酵紅葡萄酒后又經(jīng)蒸餾白蘭地的紅葡萄籽（曬干及未曬干）的原花青素含量高于發(fā)酵紅葡萄酒后未蒸餾的葡萄籽皮，表明葡萄籽中原花青素含量高于葡萄皮。

高效液相色譜測(cè)定結(jié)果顯示國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的尖峰和安陽(yáng)原花青素與成都曼斯特原花青素標(biāo)準(zhǔn)品有相同的特征峰，且都含有兒茶素和表兒茶素；7種澳大利亞原花青素保健品有相似的特征峰，但與國(guó)內(nèi)3種原花青素標(biāo)準(zhǔn)品在45～55min處有較大不同；實(shí)驗(yàn)室以發(fā)酵紅葡萄酒后未經(jīng)蒸餾的葡萄籽皮提取的原花青素與原花青素標(biāo)準(zhǔn)品最一致，且峰值較大，與硫酸香草醛法和福林—肖卡法的測(cè)定結(jié)果不同，這也表明HPLC在本實(shí)驗(yàn)中適用于定性而非定量。

對(duì)于葡萄籽中原花青素的提取，雖然新鮮葡萄籽中的含量較高，但是原料不易獲得，成本較高，而作為葡萄酒廠的廢料—發(fā)酵紅葡萄酒后的紅葡萄籽皮（或者發(fā)酵紅葡萄酒后又經(jīng)蒸餾白蘭地的紅葡萄籽），量大、易獲取，且成本低，較宜作為工廠的生產(chǎn)原料，且將葡萄酒廠的廢料進(jìn)一步生加工成保健品的方法也有利于環(huán)境保護(hù)。

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