腌制過(guò)程中添加木瓜蛋白酶對(duì)豬肉糜的影響

叢懿潔，孫為正，崔 春，趙謀明，楊園媛

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641）

在肉制品加工過(guò)程中，腌制是常見(jiàn)工序之一。腌制是通過(guò)在肉腌制過(guò)程中添加腌制劑以利于加強(qiáng)肉的保存性、形成成熟風(fēng)味，提高肉的發(fā)色性和保水性，施加咸味。腌制劑通常使用食鹽、亞硝酸鈉等發(fā)色劑、復(fù)合磷酸鹽等保水劑、香辛料和食糖等。肉在腌制中所產(chǎn)生的變化主要有：由蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生組織的柔軟化，生成肽、氨基酸等呈味成分，由脂肪分解生成脂肪酸、醛等風(fēng)味成分，由糖類(lèi)分解生成有機(jī)酸、乙醇等[1]。通過(guò)腌制，組織、風(fēng)味等特征都由生肉轉(zhuǎn)化為加工品。肉的腌制已作為重要的加工手段在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，其在肉制品加工中占有十分重要的地位。肉類(lèi)在凍藏過(guò)程中硬度變大，色澤變深，水分蒸發(fā)產(chǎn)生干耗，導(dǎo)致最終肉品質(zhì)的劣變，且凍藏過(guò)程中蛋白質(zhì)變性，肉中的內(nèi)源性酶在低溫下活性降到最低甚至幾乎沒(méi)有活性，而內(nèi)源性酶如組織蛋白酶在肉中的作用極為重要，它們?cè)谌忸?lèi)的成熟過(guò)程中扮演重要角色，可引起肉的嫩化及肉中蛋白質(zhì)降解和風(fēng)味物質(zhì)形成[2]。木瓜蛋白酶因其穩(wěn)定性好，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等均具有強(qiáng)的水解能力，是最常用的植物蛋白酶[3]。國(guó)內(nèi)關(guān)于木瓜蛋白酶對(duì)肉的研究一般局限在通過(guò)測(cè)定肉的剪切力來(lái)判定肉嫩度的變化，關(guān)于腌制過(guò)程中添加蛋白酶對(duì)肉其他品質(zhì)的影響尚鮮有報(bào)道。肉腌制中添加木瓜蛋白酶，不僅改善肉的質(zhì)構(gòu)特性，同時(shí)由酶降解肉蛋白形成氨基酸等多種小分子風(fēng)味物質(zhì)，更易溶于水中，提高肉的保水性，從而提高生肉糜在冷藏期間的品質(zhì)；在后期肉熟化過(guò)程中，這些氨基酸更易于與肉中添加的糖結(jié)合進(jìn)行美拉德反應(yīng)，得到新的風(fēng)味化合物，從而增加肉制品的口感和風(fēng)味，并且美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具備一定的抗氧化能力，能夠延長(zhǎng)肉制品的貨架期[4]。因此，肉制品加工前期加酶腌制對(duì)肉糜品質(zhì)的研究十分有必要，實(shí)驗(yàn)通過(guò)在肉糜中添加不同含量的木瓜蛋白酶，測(cè)定肉糜水溶性提取物中的總氮和氨氮的含量來(lái)確定酶對(duì)肉中蛋白的降解作用程度，并對(duì)肉糜進(jìn)行質(zhì)構(gòu)、色澤等分析，在一定程度上對(duì)凍藏肉中內(nèi)源酶活性降低形成補(bǔ)缺作用，同時(shí)為肉糜的腌制及肉制品的后期加工提供一定的理論依據(jù)，對(duì)實(shí)際肉制品的加工和生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料肉 購(gòu)于華南理工大學(xué)后勤綜合樓；木瓜蛋白酶（8.0×105U/g） 廣州裕立寶生物科技有限公司；六偏磷酸鹽、多聚磷酸鹽、焦磷酸鹽等 均為分析純；食鹽、食糖等 均購(gòu)于華南理工大學(xué)后勤綜合樓。

MM12型絞肉機(jī) 廣東省韶關(guān)市食品機(jī)械廠；CT-400型色差儀 柯尼卡美能達(dá)光電股份有限公司；TA.XT2i型物性測(cè)試儀：配有P/50探頭 美國(guó)Micro Stable公司；KDN-102F型自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；TIM 840型甲醛滴定儀 法國(guó)Radiometer analytical公司；Dew Point 4TE型水分活度儀 美國(guó)Aqualab公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉糜配方（以投料計(jì)） 瘦肉∶肥肉=8∶1；食鹽：2%；食糖：15%；復(fù)合磷酸鹽（六偏磷酸鹽∶多聚磷酸鹽∶焦磷酸鹽=1∶1∶1）：0.3%；木瓜蛋白酶：0%～0.10%。

1.2.2 測(cè)定方法 將原料肉絞碎，所用孔板直徑為6mm，根據(jù)以上配方添加腌制劑，滾揉后置于4℃冰箱腌制18h。將腌制好的肉糜分為兩部分，一部分以1∶10比例加蒸餾水，并在8000r/min高速均質(zhì)1min，10000r/min離心20min，取上清液備用。剩下的肉糜留備用。

清液總氮測(cè)定：采用KDN-102F自動(dòng)定氮儀測(cè)定。

清液氨氮測(cè)定：采用TIM 840甲醛滴定儀測(cè)定。

肉糜色差測(cè)定：采用CR-400便攜式色差儀測(cè)定CIE L*，CIE a*，CIE b*。

肉糜水分活度測(cè)定：采用Dew Point 4TE水分活度儀測(cè)定。

肉糜pH的測(cè)定：稱取5g腌制好的豬肉糜到小燒杯中，加入45mL蒸餾水，作10倍稀釋?zhuān)瑪嚢?0min。室溫靜置10min左右，將電位計(jì)上的玻璃電極直接插入燒杯中的肉和水混合物內(nèi)，3～5s內(nèi)數(shù)據(jù)穩(wěn)定后讀數(shù)[5]。

肉糜物性指標(biāo)的測(cè)定：采用物性測(cè)試儀測(cè)定腌制后肉糜的質(zhì)構(gòu)特性，參數(shù)設(shè)定按照文獻(xiàn)[6]稍作調(diào)整。具體測(cè)定參數(shù)如下：探頭P/50；測(cè)前速度2mm/s，測(cè)中速度1mm/s，測(cè)后速度2mm/s，間隔時(shí)間5s，數(shù)據(jù)收集率200點(diǎn)/s，壓縮比50%，觸發(fā)力5g，觸發(fā)類(lèi)型auto，每組6個(gè)重復(fù)。測(cè)試完用自帶的軟件Texture Expert Exceed 2.64a內(nèi)部宏TPA.MAC對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行處理。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 18.0軟件包對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行分析，差異性分析采用鄧肯（Duncan）法，相關(guān)性分析采用皮爾遜（Pearson）法。應(yīng)用Origin 7.5進(jìn)行作圖。

表1 TPA實(shí)驗(yàn)主要參數(shù)及其定義Table 1 Main parameters and definition of TPA

2 結(jié)果與討論

2.1 肉糜水溶性總氮和氨氮的變化

表2 不同添加量的酶對(duì)水溶性總氮及氨氮含量的影響Table 2 Effect of different enzyme content on water soluble total nitrogen and ammonia nitrogen

由表2可見(jiàn)，腌制過(guò)程中隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，肉糜的水溶性總氮、氨氮含量均顯著升高（p＜0.05），其中總氮含量提高了1.2倍，氨氮含量提高了5倍。由此可知，肉糜在加入少量的酶腌制后發(fā)生一定的降解作用，大分子蛋白降解成小分子肽、氨基酸等，這些小分子更易溶于水而被提取出來(lái)。且隨著酶添加量的增加，酶的作用效果越明顯，降解作用程度越大，生成的游離氨氮越多。P Gou[7]發(fā)現(xiàn)，隨著腌制時(shí)間增加，總氮和非蛋白氮含量均顯著升高（p＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在4℃條件下，木瓜蛋白酶仍具備一定活力，對(duì)肉中蛋白降解作用也十分明顯。

2.2 肉糜水分活度的變化

表3 不同添加量的酶對(duì)肉糜水分活度的影響Table 3 Effect of different enzyme content on water activity

由表3可以看出，當(dāng)酶添加量不大于0.08%時(shí)，隨著酶添加量的增加，肉糜水分活度沒(méi)有顯著性變化（p＞0.05），但當(dāng)酶添加量達(dá)到0.10%時(shí)，肉糜的水分活度顯著降低（p＜0.05）。分析實(shí)驗(yàn)原因，由于酶添加量較低，其嫩化程度較低，未起到提高肉糜保水性的作用，當(dāng)酶添加量達(dá)到0.10%時(shí)，肉在木瓜蛋白酶的作用下降解程度較大，木瓜蛋白酶將肌動(dòng)球蛋白分解為肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，肌動(dòng)蛋白易溶于水，使肉糜的保水性增強(qiáng)，從而使肉糜的水分活度顯著降低。

2.3 肉糜pH的變化

圖1 不同添加量的酶對(duì)pH的影響Fig.1 Effect of different enzyme content on pH

由圖1可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，添加酶后，pH顯著降低（p＜0.05），且隨著酶添加量的增加，pH保持降低趨勢(shì)，即酶添加量對(duì)肉糜pH具有顯著影響（p＜0.05）。理論上，由于木瓜蛋白酶作用于肉中肌原纖維蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白等，蛋白質(zhì)降解時(shí)會(huì)有羧基和氨基產(chǎn)生，而羧基會(huì)電離產(chǎn)生H+，使pH下降，由此設(shè)想，隨著降解反應(yīng)的進(jìn)行，pH不斷下降。譚光軒[8]在探究木瓜蛋白酶水解蛋白質(zhì)pH變化與可溶性蛋白關(guān)系的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在酶解大豆蛋白時(shí)，隨著酶添加量升高（1%～7.5%），豆?jié){濃度下降（7%～1%），起始pH降低（9%～6.3%），且pH下降速度加快，可溶性蛋白含量增加，水解產(chǎn)物增加。崔春等[9]研究不同酶解時(shí)間對(duì)pH的影響，其實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一般肽鍵的打開(kāi)會(huì)導(dǎo)致pH下降，在相同初始pH條件下，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)前后體系pH降低的幅度逐漸增加。

2.4 肉糜色差的變化

圖2 不同添加量的酶對(duì)肉糜色差的影響Fig.2 Effect of different enzyme content on color

由圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，腌制中添加酶后，對(duì)肉糜各色差值均有顯著影響（p＜0.05）。其中CIE L*在酶添加量為0.08%時(shí)達(dá)到最大值，相對(duì)對(duì)照組提高了10.56%；CIE a*，CIE b*均在酶添加量為0.04%時(shí)達(dá)到最大值，其中紅度值提高了23.58%，黃度值提高了65.34%。當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，各色差值呈波動(dòng)性變化，但變化不顯著。Rubén Garrido[10]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)腌制后，紅度值和黃度值都增加。

分析原因可能是，酶作用后，體系pH下降，使得肉糜表面變白，從而導(dǎo)致肉糜亮度值增加。根據(jù)Jay等[11]的報(bào)道，pH的下降可引起肉表面產(chǎn)生褪色漂白的效果，這是由于保護(hù)亞鐵血紅素的球蛋白在低pH下變性導(dǎo)致的。肉糜中添加的糖結(jié)合生成一些復(fù)雜的分子，導(dǎo)致肉糜紅度值增加。肉中食鹽及脂肪的作用可能導(dǎo)致黃度值增加，Soyer[12]研究表明，如脂肪含量、斬拌、滾揉、凍藏等工藝條件對(duì)CIE b*有較大影響。在酶添加量為一定范圍內(nèi)，當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，由于酶的作用達(dá)到一個(gè)相對(duì)極限的程度，使得色差值變得相對(duì)穩(wěn)定，沒(méi)有顯著性變化。

2.5 肉糜TPA質(zhì)構(gòu)的變化

圖3 不同添加量的酶對(duì)肉糜硬度、膠性、咀嚼性的影響Fig.3 Effect of different enzyme content on hardness，gumminess and chewiness

由圖3可見(jiàn)，腌制過(guò)程中添加木瓜蛋白酶使得肉糜的硬度、膠性顯著下降（p＜0.01），分別下降了59.06%、37.63%，但當(dāng)酶添加量大于0.02%時(shí)，肉糜硬度沒(méi)有顯著性變化（p＞0.05）；當(dāng)酶添加量小于等于0.04%時(shí)，肉糜的咀嚼性沒(méi)有顯著性變化，當(dāng)酶添加量大于0.04%時(shí)，肉糜咀嚼性相對(duì)對(duì)照組顯著下降（p＜0.05）。

分析原因是由于木瓜蛋白酶對(duì)肉產(chǎn)生作用，其作用組織主要是肌動(dòng)球蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白，木瓜蛋白酶能將肌動(dòng)球蛋白分解為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白[13-15]。膠原蛋白和彈性蛋白是結(jié)締組織的主要成分，木瓜蛋白酶對(duì)這兩種蛋白質(zhì)的作用能使結(jié)締組織降解成無(wú)定形的小塊，導(dǎo)致肉的嫩化[16]。Chunghee K Kang和Eldone Rice研究了菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、膠原酶、胰酶應(yīng)用于肉中的嫩化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶對(duì)水溶性、鹽溶性和不溶性肌肉組織片段都有較好的水解效果[17]。肌原纖維斷裂，肌纖維結(jié)構(gòu)完整性的破壞，導(dǎo)致肉的硬度下降，使肉變得更加細(xì)膩和柔和。明建等[18]利用TAXT2i物性測(cè)定儀，研究了蛋白酶嫩化處理對(duì)牛肉及其制品物性的影響，結(jié)果表明，蛋白酶處理顯著降低了牛肉的烹飪失水率、剪切力、咀嚼性、彈性、回復(fù)性、黏聚性等物性指標(biāo)，處理后牛肉的口感較好，沒(méi)有口感粗糙、韌性大而咀嚼費(fèi)力的特征。楊艷等[19]利用木瓜蛋白酶對(duì)牛肉干進(jìn)行嫩化，得出結(jié)果，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，牛肉干的硬度、咀嚼度均有所降低，降低了牛肉干的韌性，使之更易咀嚼，而且提高牛肉干的口感。

圖4 不同添加量的酶對(duì)肉糜彈性、凝聚性的影響Fig.4 Effect of different enzyme content on springiness and cohesiveness

由圖4可以看出，木瓜蛋白酶對(duì)肉糜的彈性沒(méi)有顯著性變化（p＞0.05）；與對(duì)照組相比，添加酶的各組肉糜凝聚性顯著提高（p＜0.05），但各組沒(méi)有顯著性差異，即酶添加量對(duì)凝聚性沒(méi)有顯著影響。肉糜凝聚性提高可能是由于酶對(duì)肉蛋白進(jìn)行降解，蛋白分子量下降，且產(chǎn)生小分子肽、氨基酸，這些物質(zhì)更易于促進(jìn)凝聚、交聯(lián)，提高持水性和乳化活性。熊善柏等[20]報(bào)道，蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶適度水解，保持和改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，降解生成小分子能夠改善其溶解性、乳化性、起泡性、持水性等功能特性。

由圖5可以看出，添加木瓜蛋白酶后，肉糜的黏著性顯著提高（p＜0.01），但在不同酶添加量的肉糜的黏著性中，添加量為0.08%較0.02%顯著提高（p＜0.05），其他各添加量的肉糜的黏著性沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）。這可能是由于木瓜蛋白酶作用于肌動(dòng)球蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白等的程度不同，導(dǎo)致所形成的小分子的不同，從而使黏著性在表觀上呈現(xiàn)不同。肉蛋白經(jīng)酶作用后，肌原纖維斷裂，在食鹽和食糖的作用下，肉糜變得柔軟，黏著性提高。楊艷等[19]利用不同含量的木瓜蛋白酶對(duì)牛肉干進(jìn)行嫩化，得到了同樣的結(jié)果，其分析結(jié)果為木瓜蛋白酶可以使牛肉干中的結(jié)締組織以及肌纖維中結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的膠原蛋白、彈性蛋白進(jìn)行適當(dāng)降解，在一定程度上破壞了它們的結(jié)構(gòu)。

圖5 不同添加量的酶對(duì)肉糜黏著性的影響Fig.5 Effect of different enzyme content on adhesiveness

2.6 相關(guān)性分析

由表4可知，CIE L*、CIE a*、CIE b*各色差值之間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性（p＜0.05），其中CIE a*、CIE b*之間呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性（p＜0.01）；各色差值和硬度、黏著性、凝聚性、膠性、咀嚼性之間均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性（p＜0.05），其中CIE L*和膠性、咀嚼性呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)性（p＜0.01），CIE b*和膠性、咀嚼性、硬度均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)性（p＜0.01）；表明肉糜的色澤和肉糜TPA質(zhì)構(gòu)各項(xiàng)指標(biāo)之間具有良好的相關(guān)性。這種外在的相關(guān)性只是說(shuō)明蛋白酶對(duì)豬肉糜作用使肉的色澤和肉的質(zhì)構(gòu)特性均發(fā)生變化，且二者呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，但對(duì)于肉的色澤與質(zhì)構(gòu)二者之間本身并不具備實(shí)際意義上的關(guān)聯(lián)性。

表4 各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 4 The relationship analysis between the index

關(guān)于TPA質(zhì)構(gòu)的各項(xiàng)指標(biāo)中，咀嚼性和凝聚性之間呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性（p＜0.05），除彈性其他各項(xiàng)指標(biāo)之間存在極顯著相關(guān)性（p＜0.01）；表明肉糜的質(zhì)構(gòu)各項(xiàng)指標(biāo)具有很好的相關(guān)性，這從各項(xiàng)指標(biāo)的定義也能看出來(lái)。Di Monaco等對(duì)15種食品的感官質(zhì)地研究也表明硬度與易嚼性呈顯著正相關(guān)[21]。

除水分活度外，氨氮和CIE a*之間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性（p＜0.05），和其他各指標(biāo)之間均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性（p＜0.01）；表明酶對(duì)蛋白的降解作用以及對(duì)肌纖維的斷裂作用等都是同時(shí)進(jìn)行，它們之間具備良好的相關(guān)性。除彈性、水分活度外，pH與其他指標(biāo)也均呈現(xiàn)良好的相關(guān)性（p＜0.05），pH影響的是肉糜的內(nèi)環(huán)境，當(dāng)內(nèi)環(huán)境發(fā)生微小變化，會(huì)以各項(xiàng)表觀指標(biāo)表現(xiàn)出來(lái)，包括質(zhì)構(gòu)、色差等。

3 結(jié)論

3.1 腌制過(guò)程中添加木瓜蛋白酶，肉糜中的水溶性總氮和氨氮含量顯著提高（p＜0.05），其中總氮含量提高1.2倍，氨氮含量提高5倍。

3.2 由于酶解作用，使得肉蛋白中肽鍵斷裂，生成氨基酸等物質(zhì)，從而使pH呈顯著下降趨勢(shì)（p＜0.05）。

3.3 肉糜加酶腌制后硬度、膠性呈極顯著下降趨勢(shì)（p＜0.01）；當(dāng)酶添加量較小時(shí)，肉糜的咀嚼性沒(méi)有顯著性變化，當(dāng)酶添加量大于0.04%時(shí)，肉糜咀嚼性相對(duì)對(duì)照組顯著下降（p＜0.05）；凝聚性、黏著性呈顯著升高趨勢(shì)（p＜0.05）；彈性沒(méi)有顯著性變化（p＞0.05）。

3.4 腌制中添加酶后，對(duì)肉糜各色差值均有顯著影響（p＜0.05）。其中CIE L*相對(duì)對(duì)照組提高了10.56%，CIE a*提高了23.58%，CIE b*提高了65.34%。

3.5 由相關(guān)性分析可知，色差值、TPA質(zhì)構(gòu)、氨氮、pH它們各自之間均具有良好的相關(guān)性，結(jié)果表明添加木瓜蛋白酶腌制對(duì)肉糜進(jìn)行嫩化以及肉蛋白的降解和其內(nèi)發(fā)生的各種理化變化具有一定的相關(guān)性。

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