周絡通膠囊激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2抑制糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠氧化應激

張會欣，王 超，朱慧明，崔慶飛，何奇龍，高學東，王宏濤

(1.河北以嶺醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局重點研究室，河北石家莊 050035;2.河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，河北石家莊 050051;3.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北石家莊 050035)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制尚未闡明，但大量研究表明氧化應激在DPN的發(fā)生中起到了重要作用［1－2］。NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是一種新近發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，它可以啟動多種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的活化，對抗氧化應激所致的疾病損傷［3］，但Nrf2在DPN中氧化應激的作用報道并不多見。周絡通膠囊為已獲臨床批件的治療DPN的中藥新藥，由黃芪、桂枝、當歸、生地、細辛等12味中藥組成，具有通絡祛瘀止痛之功效，動物實驗表明周絡通對DPN顯示了很好的療效［4］。本實驗用周絡通膠囊治療DPN小鼠，觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位對DPN氧化應激損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 KK/Upj-Ay小鼠，30～40 g;C57BL/6小鼠，25 ～30 g，均為 SPF 級，♂，12 周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號:0225144。

1.2 藥品與試劑 周絡通膠囊由黃芪、桂枝、當歸、生地、細辛等12味中藥組成，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)試劑盒、丙二醛 (malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase;glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(hydrogen peroxidase，CAT)試劑盒購自南京建成生物研究所;Nrf2、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS)引物由上海生工生物技術(shù)公司合成;兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗HO-1多克隆抗體、兔抗γ-GCS多克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.3 儀器 BL-420F生理記錄儀(成都泰盟);7080全自動生化分析儀(日立);7300熒光定量PCR儀(ABI公司);凝膠成像分析儀(Biorad)。

1.4 動物分組與給藥 KK/Upj-Ay小鼠，40只，按空腹血糖值(FBG)分為4組:模型組(Model)、周絡通高、中、低劑量組(ZLT-H，ZLT-M，ZLT-L)，另設(shè)C57BL/6小鼠為對照組(Control)，每組10只動物。周絡通高、中、低劑量組分別灌胃給予6.85、3.43、1.71 g生藥·kg－1的周絡通膠囊，對照組和模型組給予等體積的蒸餾水，每日1次，連續(xù)12周。

1.5 坐骨神經(jīng)傳導速度(MNCV)測定［5］給藥結(jié)束，小鼠麻醉后俯臥位固定，連接生理記錄儀，在右側(cè)坐骨切跡插入刺激電極，在踝部(遠端)和左足底第2趾間分別插入記錄電極，記錄雙通道復合動作電位(以兩對記錄電極間距離S(mm)除以兩通道復合動作電位潛伏期之差△t(ms)來計算MNCV)。每間隔1 min，重復電刺激3次取其平均值，計算其MNCV。

1.6 血液指標測定 每月1次尾靜脈采血，羅氏血糖儀測定FBG;給藥結(jié)束取血，按試劑盒的說明書測定HbA1c含量;比色法測定SOD、GSH-Px活性和CAT、MDA 含量。

1.7 熒光定量PCR方法測定坐骨神經(jīng)Nrf2、HO-1、γ-GCS mRNA的表達 取坐骨神經(jīng)，提取RNA，1 μg RNA按說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，熒光定量PCR儀擴增，Nrf2引物:上游:5'-AGTGACTCGGAAATGGAGGAG-3'，下游:5'-TGTGCTGGCTGTGCTTTAGG-3'，產(chǎn)物片段77bp;HO-1引物:上游:5'-GCTGGTGATGGCTTCCTTGT-3'，下游:5'-ACTGGGTTCTGCTTGTTGCG-3'，產(chǎn)物片段 75bp;γ-GCS 引物:上游:5'-GCACATCTACCACGCAGTCA-3'，下游:5'-CAGAGTC TCAAGAACATCGCC-3'，產(chǎn)物片段142bp;GAPDH引物:上 游:5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3'，下游:5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3'，產(chǎn)物片段143 bp。擴增條件:94℃，5 min預變性，94℃ 30 s變性、55℃ 30 s退火、72℃ 30 s延伸，進行40個循環(huán)的擴增，于每個循環(huán)的延伸階段收集熒光信號。擴增結(jié)束后進入分析界面，以GAPDH作為內(nèi)參照，根據(jù)每個樣本擴增曲線的Ct值計算各目的基因表達水平的相對定量值，對照組設(shè)置為1，最終結(jié)果計為與對照組進行比較后的相對定量值RQ用于統(tǒng)計分析。

1.8 Western blot法檢測坐骨神經(jīng)總 Nrf2、核Nrf2、HO-1、γ-GCS蛋白的表達 取坐骨神經(jīng)20 mg，加入200 μl裂解液提取總蛋白質(zhì)(核內(nèi)蛋白)，Bradford法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(1∶200)孵育過夜，加入相應的二抗(1∶1 000)，漂洗，化學發(fā)光法顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。GAPDH作為內(nèi)參照。用目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進行比較。

2 結(jié)果

2.1 FBG及HbA1c的變化 模型組FBG明顯高于對照組，周絡通治療后FBG逐漸下降，高劑量組治療12周后差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);其中，模型組、周絡通低、中、高劑量組各有1只小鼠死亡。給藥治療12周后，模型組HbA1c明顯高于正常組，周絡通高劑量組比模型組HbA1c明顯降低(P＜0.01)。見 Tab 1，2。

Tab 1Effects of ZLT on FBG in KK mice(±s)

Tab 1Effects of ZLT on FBG in KK mice(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group FBG/mmol·L －1 Before 4 wk 8 wk 12 wk Control 5.99 ±1.33＊＊ 4.98 ±0.89＊＊ 5.97 ±1.01＊＊ 6.12 ±0.98＊＊Model 12.59 ±2.68 11.92 ±2.84 12.57 ±3.51 11.47 ±2.89 ZLT-L 12.06 ±2.08 11.96 ±1.64 11.80 ±1.91 10.32 ±1.89 ZLT-M 13.50 ±1.50 13.29 ±2.87 10.92 ±2.90 10.18 ±2.77 ZLT-H 12.08 ±2.13 11.92 ±2.28 10.13 ±1.32 8.58 ±1.47*

2.2 坐骨神經(jīng)傳導速度的變化 模型組比對照組MNCV明顯減慢(P＜0.01)，周絡通低、中、高劑量組MNCV與模型組比較明顯增快(P＜0.05，P＜0.01)。見Tab 2。

Tab 2Effects of ZLT on MNCV in KK mice(±s)

Tab 2Effects of ZLT on MNCV in KK mice(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group n HbA1c/% MNCV/m·s －1 Control 10 3.98 ±0.78＊＊ 24.85 ±4.23＊＊Model 9 9.53 ±1.29 5.20 ±1.49 ZLT-L 9 9.12 ±0.99 7.71 ±1.81*ZLT-M 9 8.90 ±0.82 9.74 ±1.83＊＊ZLT-H 9 6.35 ±1.14＊＊ 10.71 ±1.81＊＊

2.3 氧化指標的變化 模型組比對照組 SOD、GSH-Px、CAT活性均明顯下降(P＜0.01)，MDA 含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，周絡通低劑量組MDA含量降低(P＜0.05)，中劑量組 SOD、GSH-Px活性上升(P＜0.05)，MDA含量降低(P＜0.05)，高劑量組 SOD、GSH-Px、CAT活性均上升(P＜0.01)，MDA含量降低(P＜0.01)。見Tab 3。

Tab 3 Effects of ZLT on SOD，GSH-Px，CAT and MDA level in KK mice(±s)

Tab 3 Effects of ZLT on SOD，GSH-Px，CAT and MDA level in KK mice(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

Group n SOD/U·ml－1 GSH-Px/U·ml－1 CAT/U·g－1 MDA/μmol·L －1 Control 10 80.34 ±12.39＊＊ 91.68±20.39＊＊ 219.95±32.86＊＊ 5.59 ±1.84＊＊Model 9 44.61 ±10.56 45.62 ±10.69 117.28 ±25.64 12.68 ±3.86 ZLT-L 9 49.26 ±9.84 52.69 ±10.58 130.64 ±28.64 9.11 ±2.06*ZLT-M 9 60.81 ±10.97* 59.88 ±11.35* 136.52 ±27.92 8.59 ±1.94*ZLT-H 9 68.95 ±11.76＊＊ 70.66±14.21＊＊ 164.27±30.23＊＊ 7.65 ±1.54＊＊

2.4 坐骨神經(jīng) Nrf2、HO-1、γ-GCS mRNA 表達的變化 模型組HO-1、γ-GCS mRNA表達明顯高于對照組(P＜0.01)，與模型組比較，周絡通低、中、高劑組HO-1 mRNA表達明顯上升(P＜0.05，P＜0.01)，周絡通低、高劑量組γ-GCS mRNA表達明顯上升(P＜0.01)，Nrf2 mRNA表達在各組無差異(P＞0.05)。見 Tab 4，F(xiàn)ig 1。

Tab 4 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS mRNA expression in KK mice(±s，n=3)

Tab 4 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS mRNA expression in KK mice(±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs model group

Group NRF HO-1 γ-GCS Control 1.02 ±0.10 1.02 ±0.13＊＊ 1.02 ±0.11＊＊Model 1.00 ±0.10 2.94 ±0.31 4.21 ±0.45 ZLT-L 1.16 ±0.12 3.78 ±0.40* 7.01 ±0.70＊＊ZLT-M 1.23 ±0.11 4.01 ±0.35＊＊ 5.35 ±0.47 ZLT-H 0.98 ±0.08 5.70 ±0.42＊＊ 8.48 ±0.61＊＊

Fig 1 PCR amplification curve of Nrf2，HO-1，γ-GCS and GAPDH

2.5 坐骨神經(jīng)總 Nrf2、核 Nrf2、HO-1、γ-GCS 蛋白表達的變化 模型組核Nrf2、HO-1、γ-GCS蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，與模型組比較，周絡通中、高劑量組核 Nrf2、HO-1、γ-GCS蛋白表達明顯上升(P＜0.05，P＜0.01)，總Nrf2蛋白表達在各組無差異(P＞0.05)。見Tab 5，F(xiàn)ig 2。

Tab 5 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS protein expression in KK mice(±s，n=3)

Tab 5 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS protein expression in KK mice(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Total Nrf2 Intranuclear Nrf2 HO-1 γ-GCS Control0.55 ±0.06 0.38 ±0.05*0.37 ±0.05＊＊ 0.30 ±0.04*Model 0.58 ±0.07 0.59 ±0.08 0.61 ±0.06 0.47 ±0.06 ZLT-L 0.61 ±0.07 0.65 ±0.09 0.67 ±0.09 0.52 ±0.06 ZLT-M 0.57 ±0.08 0.81 ±0.10*0.82 ±0.11* 0.75 ±0.07＊＊ZLT-H 0.59 ±0.06 0.93 ±0.12*0.88 ±0.09* 0.89 ±0.09＊＊

3 討論

在機體組織正常情況下，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當機體受到有害刺激時，如高血糖，可以通過多種途徑介導產(chǎn)生過多的氧自由基，導致氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，引起組織損傷［6］。機體內(nèi)存在有非酶抗氧化系統(tǒng)和酶抗氧化系統(tǒng)，前者包括維生素 C、維生素 E、谷胱甘肽等，后者有SOD、CAT、GSH-Px等，抗氧化系統(tǒng)防御功能損害也會導致組織損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)，在DPN小鼠模型中，血清MDA含量明顯升高，SOD、GSH-Px、CAT活性明顯下降，說明高糖狀態(tài)下，自由基產(chǎn)生增多和(或)抗氧化防御功能下降導致了DPN小鼠氧化應激的產(chǎn)生。周絡通干預組在治療12周時能降低糖化血紅蛋白，提高坐骨神經(jīng)傳導速度，并能降低血清中MDA的含量，提高SOD、GSH-Px、CAT活性，同時光鏡觀察到周絡通能改善坐骨神經(jīng)的軸索退變，崩解病理改變，提示周絡通能有效減低DPN小鼠的氧化應激損傷，發(fā)揮其保護作用。

Fig 2 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS protein expression

Nrf2 是一種轉(zhuǎn)錄因子，最新的研究顯示［7－8］，敲除Nrf2基因的小鼠易于發(fā)生氧化應激，機體內(nèi)的酶抗氧化系統(tǒng)有可能是通過Nrf2的轉(zhuǎn)錄激活啟動的。正常情況下，Nrf2和它的細胞質(zhì)接頭蛋白Keap1作為細胞抗氧化反應的中樞調(diào)節(jié)者，偶聯(lián)被封閉在細胞質(zhì)中，在氧化應激狀態(tài)下，Keap1構(gòu)型發(fā)生變化，Nrf2與Keap1分離，Nrf2向細胞核中轉(zhuǎn)運和活化，啟動其下游多種抗氧化蛋白表達和Ⅱ相解毒酶的合成，如 HO-1、γ-GCS、SOD、CAT 等，減輕氧化應激引起的損傷［9］，已有文獻［10－11］報道了一些化學物質(zhì)或藥物能夠激活Nrf2、啟動對靶基因的調(diào)控，減輕組織損傷。

我們的實驗觀察到DPN模型小鼠坐骨神經(jīng)中核內(nèi)Nrf2蛋白表達明顯升高，同時 HO-1、γ-GCS mRNA和蛋白表達亦明顯升高，表明高糖引起的DPN導致了 Nrf2核轉(zhuǎn)錄，進而導致下游 HO-1、γ-GCS表達升高，給予周絡通干預后，核內(nèi)Nrf2、HO-1、γ-GCS表達進一步升高，表明周絡通能有效促進Nrf2的核轉(zhuǎn)位，進而增加了抗氧化蛋白HO-1和γ-GCS的表達，提示周絡通對DPN小鼠的抗氧化應激損傷與其促進Nrf2核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

［1］王 萌，王瑞英，王素星.氧化應激與糖尿病周圍神經(jīng)病變［J］.臨床薈萃，2009，24(5):449－51.

［1］Wang M，Wang R J，Wang S X.Oxidatio and diabetic peripheral neuropathy［J］.Clin Focus，2009，24(5):449－51.

［2］Al-Nimer M S，Al-Ani F S，Ali F S.Role of nitrosative and oxidative stress in neuropathy in patients with type 2 diabetes mellitus［J］.J Neurosci Rural Pract，2012，3(1):41－4.

［3］Williamson T P，Johnson D A，Johnson J A.Activation of the Nrf2-ARE pathway by siRNA knockdown of Keap1 reduces oxidative stress and provides partial protection from MPTP-mediated neurotoxicity［J］.Neurotoxicology，2012，33(3):272－9.

［4］封衛(wèi)毅，侯家玉，陳 偉，等.周絡通對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)功能、醛糖還原酶活性及抗自由基能力的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2004，27(1):45－8.

［4］Feng W Y，Hou J Y，Chen W，et al.Effects of Zhouluotong on the function of sciatic nerve，activity of aldose reductase and ability of aldose reductase against free radicals in the rats with diabetes［J］.J Beijing Univ TCM，2004，27(1):45－8.

［5］姚鴻萍，封衛(wèi)毅，魏友霞，董海燕.大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度測定的方法學考察［J］.中國藥房，2011，22(1):18－20.

［5］Yao H P，F(xiàn)eng W Y，Wei Y X，Dong H Y.Methodology of the determination of sciatic nerve conduction velocity in rats［J］.ChinaPharmacy，2011，22(1):18－20.

［6］Stanton R C.Oxidative stress and diabetic kidney disease［J］.Curr Diab Rep，2011，11(4):330－6.

［7］Wruck C J，F(xiàn)ragoulis A，Gurzynski A，et al.Role of oxidative stress in rheumatoid arthritis:insights from the Nrf2-knockout mice［J］.Ann Rheum Dis，2011，70(5):844－50.

［8］Nakamura B N，Lawson G，Chan J Y，et al.Knockout of the transcription factor NRF2 disrupts spermatogenesis in an age-dependent manner［J］.Free Radic Biol Med，2010，49(9):1368－79.

［9］René C，Lopez E，Claustres M，et al.NF-E2-related factor 2，a key inducer of antioxidant defenses，negatively regulates the CFTR transcription［J］.Cell Mol Life Sci，2010，67(13):2297－309.

［10］李 強，趙曙光，王旭霞，等.姜黃素激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對人肝細胞氧化應激的影響［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2010，19(2):154－6.

［10］Li Q，Zhao S G，Wang X X，et al.Effect of curcumine on intracellar ROS in cultured human hepatocyte by upregulating the activity of Nrf2［J］.Chin J Gastroent Hepat，2010，19(2):154－6.

［11］Farombi E O，Shrotriya S，Na H K，et al.Curcumin attenuates dimethylnitrosamine-induced liver injury in rats through Nrf2-mediated induction of heme oxygenase-1［J］.Food Chem Toxicol，2008，46(4):1279－87.