羅格列酮對阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征模型血清和脂肪組織抵抗素、瘦素表達的影響

周 燕，湯鳳蓮，蔡姍姍

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西桂林 541001)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)可導致心腦血管疾病、內(nèi)分泌代謝紊亂、脂代謝紊亂、2型糖尿病及胰島素抵抗等相關并發(fā)癥，并與肥胖密切相關。肥胖和胰島素抵抗是OSAS主要發(fā)病環(huán)節(jié)之一，脂肪激素在胰島素抵抗以及代謝綜合征組分疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。瘦素作為一種脂肪激素，是肥胖與高胰島素血癥、胰島素抵抗聯(lián)系的關鍵所在［1］。抵抗素也是一種由脂肪細胞分泌的新的多肽類激素，由Steppan于2001年在研究抗糖尿病藥物——噻唑烷二酮類時發(fā)現(xiàn)并命名。本研究旨在觀察應用羅格列酮對OSAS豬模型進行干預性治療后對實驗動物抵抗素、表達及高胰島素血癥、胰島素抵抗的影響，探討OSAS發(fā)病機制，進一步尋找藥物治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇幼年♀清潔陸川豬23只(由桂林醫(yī)學院動物實驗中心提供)，月齡10～12周，體質(zhì)量30～40 kg，

1.1.2 主要實驗試劑 TRIzol RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(大連寶生物公司);TAq酶(北京天根生物公司);Leptin mRNA引物(上海英駿生物公司);兔抗豬Leptin一抗(博士德公司)。

1.1.3 主要實驗儀器 多導睡眠監(jiān)測儀1臺(美國泰科公司生產(chǎn));Legendmiro 17R型微量臺式高速冷凍離心機(Thermo公司);Biometra型PCR擴增儀(德國耶拿分析儀器股份公司);JS-780型全自動凝膠成析系統(tǒng)(上海培清科技);酶標儀(Labsystem MK3，芬蘭);EPS 301型SDS-PAGE電泳儀(Amersham Pharmacia Biotech公司);SD轉膜儀(BIORAD)公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備與分組 陸川豬為自然狀態(tài)下的OSAS動物模型，經(jīng)呼吸睡眠監(jiān)測其OSAS發(fā)生率為50%［2］。用普通飼料由專人喂養(yǎng)。實驗前1周所有動物均做暗適應訓練，靜脈注射安定(0.1 mg·kg－1)，誘導其進入睡眠狀態(tài)。采用多導睡眠監(jiān)測儀進行監(jiān)測其口鼻氣流、鼾聲、胸腹式呼吸、睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)及脈搏血氧飽和度，記錄時間為7 h，開始4 h為側臥位，后3 h為仰臥位。根據(jù)監(jiān)測結果，其中符合OSAS診斷標準的12只作為OSAS模型組，將OSAS模型組隨機分為兩組:OSAS組6只，羅格列酮干預組6只。在不符合OSAS診斷標準的11只中隨機選取6只作為健康對照組。羅格列酮干預組(干預組)喂服羅格列酮0.2 mg·kg－1·d－1;正常對照組(對照組)及 OSAS 模型組(模型組)給予等量生理鹽水，每天1次。各組均連續(xù)12周。實驗結束后處死各組實驗動物提取大網(wǎng)膜脂肪組織，分別用DEPC水與無菌冰生理鹽水沖洗并剪成0.5 g大小的脂肪塊，分裝在無菌EP管中密封，迅速液氮冷凍，－80℃保存，DEPC水沖洗過的留做RT-PCR，生理鹽水沖洗過的留做蛋白質(zhì)免疫印跡分析(Western blot方法)。

1.2.2 血清學指標檢測 所有受試對象均禁食過夜12 h，用20%烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉后，抽取耳緣靜脈血5 ml，檢測空腹抵抗素、瘦素、空腹血糖、胰島素、胰島素原，采用HOMA模型公式計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR=(胰島素×血糖)/22.5。抵抗素、瘦素采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)，試劑盒購自美國 Phoenix Pharmaceutical公司，血糖采用葡萄糖氧化酶法，胰島素、胰島素原采用放射免疫(RIA)法。

1.2.3 RT-PCR法檢測脂肪組織抵抗素、瘦素mRNA基因的表達

1.2.3.1 提取脂肪組織總RNA 將超低溫凍結的RNA提取樣品迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研棒研磨組織，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀，取研磨成粉末狀的樣品100 mg加入到含有1 ml RNAiso plus的2 ml EP管中，輕搖混勻，置于冰浴上勻漿5 min，反復離心，浴上勻漿 5 min，12 000 r·min－14 ℃離心5 min;加入200 μl氯仿，震蕩混勻，冰浴上靜置 5 min，12 000 r·min－14℃離心 15 min;將上清液移至新的1.5 ml EP管中，加入與上清液等體積的異丙醇，冰浴上靜置10 min，12 000 r·min－14℃離心10 min;棄上清保留沉淀，加入1 ml 75%乙醇，12 000 r·min－14 ℃離心5 min;棄上清保留沉淀，干燥;溶解于30～50 μl DEPC處理水中。用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。

1.2.3.2 總RNA 逆轉錄成cDNA 各取1 μg RNA按試劑盒操作說明逆轉錄為cDNA。

1.2.3.3 目的基因片段的 PCR擴增 取1 μl cDNA為模板，分別以瘦素的引物(上游引物5'-ACAAAGGCCAGTTTACGGTT-3'，下 游 引 物 5'-ACATCTCCAGGCTTTTATGAGG-3';擴增片段約240 bp);抵抗素的引物(上游引物5'-GTCGCCAGTTTCCTAATTCCTC-3'，下游引物 5'-ACCCAGTGACAGCAAAGCCT-3';擴增片段約112 bp)與內(nèi)參照β-actin的引物(上游引物5'-CTGCGGCATCCACGACCA-3'，下游引物 5'-TACTCCTGCTTGCTTGCTGATCCAC-3';擴增片段約273 bp)進行PCR擴增，PCR反應體系為25 μl，擴增條件為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，72 ℃ 終延伸2 min。最后取擴增產(chǎn)物5 μl在含有0.5 mg·L－1溴己啶的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，產(chǎn)物條帶用凝膠成像系統(tǒng)照相并進行灰度分析。目的片段的相對表達量=目的基因的灰度值/β-actin的灰度值。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡分析抵抗素、瘦素蛋白含量提取各組脂肪組織總蛋白，用BSA試劑盒測定總蛋白濃度，根據(jù)標本蛋白濃度計算上樣量，使每孔蛋白上樣量一致;行SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至硝酸纖維素濾膜上;將膜用5%的脫脂奶粉封閉后，加入抗抵抗素單克隆抗體、抗瘦素單克隆抗體(稀釋度1∶500)，室溫孵育1 h;洗膜后加入二抗鼠抗兔IgG(稀釋度1∶1 000)室溫孵育1 h;PBST充分洗滌后，用化學發(fā)光顯影藥盒顯影，X線膠片曝光記錄影像;凝膠成像分析系統(tǒng)分析膠片，讀取各目的條帶及β-actin的光密度值，計算其比值。

2 結果

2.1 羅格列酮對OSAS模型睡眠監(jiān)測結果的影響

與模型組比較，干預組 AI、AHI下降，最低SaO2

增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見Tab 1。

Tab 1 The influence of rosiglitazone on sleep monitoring results of OSAS model(±s，n=6)

Tab 1 The influence of rosiglitazone on sleep monitoring results of OSAS model(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs model group

Group AI/h AHI/h minSaO2/%Control 2.35 ±0.10 3.13 ±0.20 91.60 ±2.75 Model 29.50 ±10.55＊＊ 34.67 ±15.28＊＊ 75.69 ±8.52＊＊Treatment 12.65 ±7.10＊△ 17.38 ±6.46＊△ 82.37 ±6.89＊△

2.2 羅格列酮對OSAS模型血清抵抗素、瘦素表達的影響 與對照組比較，模型組血清抵抗素、瘦素、血糖、胰島素、胰島素原水平與HOMA-IR均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與模型組比較，干預組上述指標數(shù)值下降，但血清抵抗素、瘦素水平仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見Tab 2。

2.3 羅格列酮對OSAS模型抵抗素mRNA、瘦素mRNA表達的影響 RT-PCR的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:正常對照組、模型組和羅格列酮干預組均在240 bp處有特異性的抵抗素mRNA、瘦素mRNA表達條帶(Fig 1a-b)。與對照組比較，模型組抵抗素mRNA、瘦素mRNA表達量高于對照組(P＜0.01);與模型組比較，干預組抵抗素mRNA、瘦素mRNA表達量低于模型組(P＜0.05)，但仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見Tab 3、Fig 1a－b。

Tab 2The influence of rosiglitazone on serum resistin，leptin of OSAS model(±s，n=6)

Tab 2The influence of rosiglitazone on serum resistin，leptin of OSAS model(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs model group

group Leptin/μg·L －1 Resistin/μg·L －1 Insulin/pmol·L－1 Proinsulin/pmol·L－1Blood sugar/mmol·L－1HOMA-IR Control Model Treatment 12.58 ±5.04 23.64 ±8.49＊＊19.11 ±10.72＊△41.50 ±5.69 54.09 ±5.06＊＊46.53 ±6.43＊△3.70 ±0.51 103.18 ±6.20*4.78 ±0.71△0.37 ±0.64 9.49 ±1.03*0.44 ±0.04△5.33 ±0.71 11.94 ±2.51*7.50 ±0.75△0.88 ±0.13 54.97 ±13.09*1.59 ±0.25△

Tab 3 The influence of rosiglitazone on resistin mRNA、leptin mRNA of OSAS model(±s，n=6)

Tab 3 The influence of rosiglitazone on resistin mRNA、leptin mRNA of OSAS model(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs model group

Group Resistin mRNA Leptin mRNA Control 0.23 ±0.08 0.04 ±0.02 Model 0.54 ±0.03＊＊ 0.16 ±0.02＊＊Treatment 0.37 ±0.01△ 0.10 ±0.01＊△

Fig 1a The difference of groups adipose tissue resistiin mRNA expression after 12 weeks of rosiglitazone treatment

Fig 1b The difference of groups adipose tissue leptin mRNA expression after 12 weeks of rosiglitazone treatment

2.4 羅格列酮對OSAS模型抵抗素蛋白、瘦素蛋白表達量的影響 蛋白質(zhì)免疫印跡分析(Western blot方法)結果顯示:Western印跡發(fā)現(xiàn)大約65 ku分子量位置上出現(xiàn)陽性條帶，經(jīng)掃描發(fā)現(xiàn):與對照組比較，模型組抵抗素、瘦素蛋白表達水平高于對照組(P＜0.01);與模型組比較，干預組抵抗素、瘦素蛋白表達水平低于模型組(P＜0.05)，但仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見Tab 4、Fig 2ab。

Tab 4 The influence of rosiglitazone on resistin、leptin protein expression of OSAS model(±s，n=6)

Tab 4 The influence of rosiglitazone on resistin、leptin protein expression of OSAS model(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs model group

Group Resistin Leptin Control 0.35 ±0.13 0.032 Model 0.68 ±0.12＊＊ 0.172＊＊Treatment 0.51 ±0.07△ 0.109＊＊△

Fig 2a The difference of groups adipose tissue resistiin protein expression after 12 weeks of rosiglitazone treatment Fig 2b The difference of groups adipose tissue leptin protein expression after 12 weeks of rosiglitazone treatment

3 討論

現(xiàn)已證實OSAS為其他許多疾病的共同病理基礎，具有相當大的潛在危險［3］，與肥胖密切相關。目前對OSAS的病因、發(fā)病機制尚不完全清楚，新近研究認為，脂肪細胞因子是導致OSAS發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素［4］。瘦素是攝食調(diào)控網(wǎng)絡中的上游因子，通過降低動物食欲、提高能量代謝效率、增加能量消耗、減少脂肪儲存而減輕體質(zhì)量。瘦素可以從多個途徑參與肥胖調(diào)節(jié)［5］。抵抗素也是一種由脂肪細胞分泌的新的多肽類激素，其作用是對抗胰島素的效應，使血糖升高，同時刺激脂肪細胞增殖，而導致肥胖。本研究發(fā)現(xiàn)，OSAS豬模型血清抵抗素、瘦素水平明顯升高，脂肪組織抵抗素mRNA、瘦素mRNA及蛋白表達灰度值升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。研究發(fā)現(xiàn)OSAS患者血清瘦素水平較非OSAS者升高，與體重指數(shù)、胰島素抵抗指數(shù)呈正相關，且與OSAS患者病情的嚴重程度存在相關性［6］。迄今為止，有兩項小型研究觀察抵抗素和成人OSAS的關系，發(fā)現(xiàn)在不同嚴重程度的的患者，抵抗素水平與炎癥水平相關，隨著OSAS嚴重程度的增加抵抗素水平增加，CPAP治療后降低［7］，而本研究則進一步從分子水平、蛋白水平等方面研究脂肪激素與OSAS發(fā)生發(fā)展的關系。引起OSAS體內(nèi)抵抗素、瘦素水平升高的機制可能為［8］:OSAS患者睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)增加，夜間血氧飽和度下降，進而引起交感神經(jīng)興奮、血管緊張素升高、血壓波動，這些均可導致抵抗素、瘦素水平升高。另外，本研究結果還顯示:與對照組比較，OSAS模型組血糖、胰島素、胰島素原水平、HOMA-IR均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);提示OSAS存在高血糖、高胰島素血癥及胰島素抵抗等并發(fā)癥。

目前藥物治療0SAHS沒有明確的效果。羅格列酮屬噻唑烷二酮類藥物，是有效的核轉錄因子過氧化酶體增殖激活受體γ(PPARγ)的選擇性激動劑。作為一種新型的胰島素增敏劑，羅格列酮具有拮抗胰島素抵抗、降低高血糖、改善脂代謝紊亂、抗動脈粥樣硬化的作用［9］。以往的研究發(fā)現(xiàn)［10］，噻唑烷二酮類藥物可通過調(diào)節(jié)脂聯(lián)素、瘦素、腫瘤壞死因子的水平而增強胰島素敏感性，改善IR。本研究結果顯示:與模型組比較，經(jīng)羅格列酮干預后AI和AHI下降，最低SaO2增加;血清抵抗素、瘦素、抵抗素mRNA表達量、瘦素mRNA表達量、抵抗素蛋白表達水平、瘦素蛋白表達水平、血糖、胰島素、胰島素原、HOMA-IR均降低，差異有統(tǒng)計學意義。這些結果均提示羅格列酮有可能通過減輕胰島素抵抗、下調(diào)體內(nèi)抵抗素、瘦素mRNA及蛋白表達量而改善OSAS模型的代謝及臨床癥狀，降低OSAS并發(fā)癥的發(fā)生率。從而為開發(fā)治療OSAS患者的藥物提供新的靶點，目前國內(nèi)外均未見此報道，

由于OSAS發(fā)病率較高，危害較大，而抵抗素、瘦素與其密切相關，因此，進一步探討OSAS與脂肪激素的內(nèi)在聯(lián)系、羅格列酮有可能通過減輕胰島素抵抗而發(fā)揮干預治療OSAS的作用，具有不可忽視的臨床意義。未來抵抗素、瘦素作為研究人類OSAS等代謝紊亂相關疾病的病理生理學標志物將越來越受到關注。

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