計數(shù)觀察 魚軟骨多糖對小鼠黑色素瘤中血管生成擬態(tài)的時空變化及對CD31的影響

孟 康，郭 斌，王 冠

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧 錦 州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

以往的研究對血管生成擬態(tài)(VM)隨時間和空間變化規(guī)律有了一定的認(rèn)識［1－2］，但對它與內(nèi)皮依賴性血管之間的關(guān)系和二者的演變過程沒有進(jìn)行深入細(xì)致的研究，尤其是在加入魟魚軟骨多糖(RCG)的條件下，對VM的研究少之又少。目前，我國在魟魚生理活性物質(zhì)的研究方面取得了一定進(jìn)展，從魟魚軟骨中提取、分離出具有抗腫瘤活性成分。本實驗通過建立C57小鼠黑色素瘤模型，觀察RCG對黑色素移植瘤的時空變化的影響及影響其變化的細(xì)胞因子CD31的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RCG可抑制B16黑色素瘤的血管生成，且可能通過降低腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞因子來抑制腫瘤細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用，從而達(dá)到抑制腫瘤新生血管形成的作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及給藥方法 清潔級C57BL/6小鼠(18～22)g，♂，60只，隨機(jī)分為5組:生理鹽水組(saline)、RCG 高劑量組(RCGH，900 mg·kg－1)、RCG 中劑量組(RCGM，300 mg·kg－1)、RCG 低劑量組(RCGL，100 mg·kg－1)、環(huán)磷酰胺(CTX)組(60 mg·kg－1)。黑色素瘤細(xì)胞株B16用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。對每只小鼠右腋下注射0.2 ml的細(xì)胞懸液。各組接種后d 2開始ip給藥，CTX組每周1次，其它各組每日1次。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表，每天抽取1只小鼠處死，共持續(xù)12 d。解剖并仔細(xì)檢查動物全身，獲得腫瘤樣本。

1.2 免疫組織化學(xué)染色和CD31、PAS雙重染色 全部樣本均經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.10福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。免疫組織化學(xué)染色和CD31、PAS雙重染色進(jìn)行觀察，免疫組織化學(xué)染色操作步驟按SP法進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 首先利用計算機(jī)圖像處理軟件計算每張切片中壞死面積，在進(jìn)行中央?yún)^(qū)與外周區(qū)的劃分時，避開腫瘤壞死，將每張切片中腫瘤組織平均分為3部分，占腫瘤組織內(nèi)約1/3部分為中央?yún)^(qū)，外1/3的部分即為外周區(qū)，其余為中間區(qū)域。把VM、內(nèi)皮依賴性血管為核心的高倍視野劃分為VM、內(nèi)皮依賴性血管附近，即中央?yún)^(qū);距離中央?yún)^(qū)一個高倍視野的腫瘤細(xì)胞即距離VM和內(nèi)皮依賴性血管較遠(yuǎn)的部分為外周區(qū)。VM判斷標(biāo)準(zhǔn):管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞，周圍沒有出血壞死和炎癥細(xì)胞浸潤，且無內(nèi)皮細(xì)胞襯復(fù)的PAS陽性管道、襯復(fù)PAS陽性物質(zhì)的腫瘤細(xì)胞圍成不規(guī)則管腔。數(shù)據(jù)以中位數(shù)的形式表示，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包對該實驗資料進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 實驗現(xiàn)象 腫瘤直徑2～10 mm，有淡黑色，表面有豐富的血管，與周圍的非腫瘤組織分界不清，切開面呈現(xiàn)紅黑色，呈浸潤生長，實性、質(zhì)地有彈性和光澤。染色后可見VM、內(nèi)皮依賴性血管等血液供應(yīng)方式共存現(xiàn)象，部分區(qū)域散在出血壞死。通過觀察CD31和PAS雙重染色，在該移植瘤的第1周內(nèi)可見到腫瘤間質(zhì)中櫻桃紅色的PAS陽性血管樣圖案，VM已形成，1周后逐漸被內(nèi)皮依賴性血管所替代。

2.2 RCG對VM時空變化的影響 通過觀察VM和內(nèi)皮依賴性血管的情況，VM密度在腫瘤中央?yún)^(qū)隨時間變化呈現(xiàn)先增加后遞減趨勢，并且RCG劑量越大，同一時刻下的血管生成密度越小。中央?yún)^(qū)的VM較多，周邊區(qū)較少，RCG影響中央?yún)^(qū)比周邊區(qū)要明顯。內(nèi)皮依賴性血管的密度變化體現(xiàn)了同樣的變化特征。內(nèi)皮依賴性血管密度在腫瘤中央?yún)^(qū)和外周區(qū)均呈現(xiàn)遞減趨勢，隨著RCG試劑組濃度的增高，同一時刻下內(nèi)皮依賴性血管的密度逐漸降低。

2.3 RCG對CD31在腫瘤不同區(qū)域的表達(dá)的影響 與生理鹽水組比較，隨著RCG各劑量組濃度的增高，VM中央?yún)^(qū)和外周區(qū)的腫瘤細(xì)胞CD31的表達(dá)逐漸降低，見Tab 1，同樣內(nèi)皮依賴性血管在腫瘤的中央?yún)^(qū)和外周區(qū)均呈現(xiàn)遞減趨勢。見Tab 2。因為統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布，故實驗中所有數(shù)據(jù)均用中位數(shù)表示。

Tab 1 Vasculogenic mimicry CD31 expression in different regions

Tab 2 Endothelium dependent period of CD31 expression in different regions

2.4 相關(guān)性分析 通過SPSS 19.0分析，在腫瘤數(shù)為20的條件下，不同濃度RCG對CD31、VM密度的表達(dá)之間存在相關(guān)性，Tab 3可得RCG與CD31、VM密度之間存在密切的負(fù)相關(guān)性。對其具有一定的抑制作用。

Tab 3 RCG and CD31 correlation analysis，RCG and angiogenesis mimicry density correlation analysis

3 討論

觀察RCG對黑色素移植瘤的時空變化的影響及影響其變化的細(xì)胞因子CD31的表達(dá)情況，研究顯示RCG可抑制B16黑色素瘤的血管生成。結(jié)果表明在不同濃度(900、300、100 mg·kg－1)的RCG下，CD31、內(nèi)皮依賴性血管的濃度和VM的密度呈線性降低(P＜0.05)。并觀察到表達(dá)CD31的腫瘤細(xì)胞在間質(zhì)中彼此黏附，具有連接形成管腔的趨勢，同時發(fā)現(xiàn)一部分襯復(fù)在PAS陽性物質(zhì)內(nèi)壁的腫瘤細(xì)胞分泌CD31抗原作為一個細(xì)胞間的連接分子，使腫瘤細(xì)胞在變形后能模仿內(nèi)皮細(xì)胞更好地連接在一起，形成血液通道。國際上通過生物試劑研制抗癌新藥的趨勢正在興起［3］，對于RCG的研究并不多見，深入研究RCG是必要的［4］。以上實驗結(jié)果提示我們，RCG對于腫瘤的治療可能具有一定的應(yīng)用價值，值得進(jìn)一步研究。

［1］蔣金玲，于穎彥.血管生成擬態(tài)是對經(jīng)典腫瘤血管生成理論的補(bǔ)充［J］.內(nèi)科理論與實踐，2010，5(2):183－6.

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