抗氧化肽SS-31對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡的影響

王月華，侯延娟，任韞卓，韋金英，杜春陽，張連珊，史永紅

(河北醫(yī)科大學病理學教研室，河北石家莊 050017)

高血糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，其造成的系膜細胞缺失是導致糖尿病腎損傷的主要機制［1－2］。高血糖引起的活性氧 (reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生對DN的發(fā)展具有至關重要的作用［3］。高糖(high glucose，HG)通過誘導ROS產(chǎn)生促進腎小球系膜細胞凋亡［1］。研究表明，ROS產(chǎn)生的主要部位是線粒體，在糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用［4］。SS-31 肽(D-Arg-2’，6’-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2)屬于小分子可滲入細胞的肽家族，能夠靶向定位和聚集在線粒體內(nèi)膜［5］。SS-31能夠清除細胞內(nèi)ROS和抑制線粒體ROS產(chǎn)生，從而防止線粒體通透性改變和細胞色素C釋放［5］。以往的研究表明，SS-31能夠抑制單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮細胞凋亡和腎小管損傷［6］。最近研究顯示，SS-31能抑制高糖誘導的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞凋亡和線粒體ROS的產(chǎn)生、穩(wěn)定線粒體膜電位、減少細胞色素C由線粒體向胞質(zhì)釋放和caspase-3表達［7］。然而，SS-31對 HG誘導的腎小球系膜細胞的凋亡作用還未見報道。本實驗旨在探討抗氧化肽SS-31對HG誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡的作用以及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠系膜細胞(CRL-1927)來自美國菌種保藏中心(Manassas，VA)。D-glucose和Mannitol為 Sigma公司產(chǎn)品。兔抗 cleaved caspase-3、p38 MAPK、p-p38 MAPK為美國 Cell Signaling公司產(chǎn)品。小鼠抗 Bax單克隆抗體(P-19)，兔抗 Bcl-2、caspase-3和細胞色素C多克隆抗體以及ECL增強化學發(fā)光試劑盒為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。TUNEL試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品。SS-31多肽由上海強耀生物科技有限公司合成。辣根酶標記羊抗小鼠或兔IgG購自北京中杉金橋公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)為美國Milipore公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組刺激實驗 以含體積分數(shù)0.1胎牛血清，2 mmol· L－1L-谷氨酰胺，100 kU·L－1青霉素和 100 mg·L－1鏈霉素的 DMEM-F12(3∶1)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細胞。待MMCs達75% ～85%融合后，用無血清培養(yǎng)基同步24 h。同步后的細胞分成4組:正常糖組(5.6 mmol·L－1葡萄糖，NG);正常糖+甘露醇組(5.6 mmol· L－1葡萄糖+24.4 mmol·L－1甘露醇，M);高糖組(30 mmol· L－1葡萄糖，HG)，高糖 +SS-31 組(30 mmol· L－1葡萄糖 +100 nmol·L－1SS-31，HG+SS-31)。于刺激 48 h后收集細胞觀察。

1.2.2 流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡 收集上清及貼壁細胞，用PBS洗2次，用體積分數(shù)0.70的乙醇4℃固定24 h，PBS洗2次，碘化丙啶避光染色30 min，流式細胞儀觀察。

1.2.3 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導dUTP缺口標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡 MMCs接種于8孔Lab-Tek?腔室玻片(美國Nalge Nunc公司)上，分組刺激48 h。根據(jù)說明書使用DeadEndTM熒光TUNEL系統(tǒng)檢測細胞凋亡。熒光顯微鏡下計數(shù)每個高倍視野中陽性染色細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算陽性細胞百分比。

1.2.4 Western印跡檢測 細胞用冰冷PBS洗2遍，加入細胞裂解液(25 mmol·L－1Tris-HCL，10 mmol·L－1EDTA，體積分數(shù) 0.01 NP-40，150 mmol·L－1氯化鈉，質(zhì)量濃度 1 g·L－1苯甲基磺酰氟)，冰浴 1 h，4 ℃、14 000 r·min－1離心 25 min，Lowry法測定上清液蛋白濃度。按照Huang等［8］所述方法分離線粒體和不含線粒體的胞質(zhì)蛋白，本次實驗使用不含線粒體的胞質(zhì)蛋白。細胞裂解蛋白50 μg，經(jīng)十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;質(zhì)量分數(shù)0.05的脫脂奶粉封閉 PVDF膜 2 h，分別加入 caspase-3、cleaved caspase-3、p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bax、Bcl-2以及細胞色素C抗體，4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔抗體(1∶5 000稀釋)，37℃孵育1.5 h;洗膜后加ECL試劑，然后將PVDF膜放入X線片暗盒，壓片，顯影，定影。用美國UVP公司LabWorks 4.5分析系統(tǒng)軟件對Western條帶進行定量分析。

1.2.5 流式細胞術(FCM)檢測細胞內(nèi)ROS 使用熒光探針5-(6)-羧基-2，7-二氯熒光素(CM-DCHFDA，Invitrogen)檢測細胞內(nèi)ROS含量。MMCs接種于6孔板內(nèi)，分組刺激48 h，洗滌細胞，胰酶消化，懸浮于 PBS，最后加入含 10 μmol·L－1DCHF-DA 的染液中，37℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 SS-31對高糖誘導的系膜細胞凋亡的影響TUNEL和流式細胞術檢測結(jié)果表明，與NG組相比，在高糖刺激48 h，小鼠系膜細胞凋亡細胞數(shù)明顯增加(P＜0.01);與HG組相比，SS-31干預能夠明顯減少高糖誘導的細胞凋亡數(shù) (P＜0.05，F(xiàn)ig 1，2)。此外，甘露醇對細胞凋亡無影響。

2.2 SS-31對高糖誘導的系膜細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與NG組相比，HG糖組cleaved caspase-3表達和 Bax/Bcl-2比率明顯增加(P＜0.01);SS-31干預能夠明顯抑制HG誘導的cleaved caspase-3表達和Bax/Bcl-2比率(P＜0.05，F(xiàn)ig 3)。此外，甘露醇對系膜細胞cleaved caspase-3表達和Bax/Bcl-2比率無影響。

2.3 SS-31對HG誘導的系膜細胞線粒體細胞色素C釋放的影響 亞細胞提取物的Western blot結(jié)果顯示:HG刺激系膜細胞48 h，與正常糖對照組相比，高糖組胞質(zhì)中的細胞色素C水平明顯增加(P＜0.01);與高糖組相比，SS-31干預組細胞胞質(zhì)中細胞色素C水平明顯降低(P＜0.05，F(xiàn)ig 4)。甘露醇組與正常對照組相比，胞質(zhì)中細胞色素C水平無差異。

Fig 1 Effect of SS-31 on HG-induced apoptosis of MMCs(analyzed by TUNEL，n=6).

Fig 2 Effect of SS-31 on HG-induced apoptosis of MMCs(analyzed by TUNEL，n=6).

Fig 3 Effect of SS-31 on activation of caspase-3 and expression of Bax and Bcl-2 in MMCs(n=6).

Fig 4 Effect of SS-31 on the release of cytochrome C from mitochondria to cytoplasm in MMCs(n=6).

2.4 SS-31對HG誘導的系膜細胞ROS產(chǎn)生的影響 流式細胞術結(jié)果顯示:HG刺激系膜細胞48 h，與正常糖對照組相比，高糖組系膜細胞ROS產(chǎn)生明顯升高(P＜0.01);SS-31干預組細胞ROS表達明顯低于高糖組(P＜0.05，F(xiàn)ig 5)。甘露醇組與正常對照組相比，ROS水平無差別。

2.5 SS-31對HG誘導系膜細胞p38 MAPK激活的影響 在高糖刺激的48 h，與NG組相比，HG組p38 MAPK的磷酸化水平明顯升高(P＜0.01);與高糖組相比，SS-31干預組p38 MAPK磷酸化水平明顯降低(P＜0.05，F(xiàn)ig 6)。甘露醇組與正常對照組相比，p38 MAPK磷酸化水平無差異。

3 討論

既往的研究已證實，在糖尿病時，腎臟存在大量ROS的蓄積，破壞了腎臟組織內(nèi)氧化還原動態(tài)平衡，造成腎組織的氧化應激狀態(tài)，參與腎損傷的發(fā)生與發(fā)展［9］。多種對實驗性糖尿病腎病具有腎臟保護藥物都具有降低腎臟氧化應激狀態(tài)的作用［10－12］。因此，調(diào)節(jié)糖尿病腎臟氧化應激狀態(tài)有可能成為有效的治療糖尿病腎病的靶點。

Fig 5 Effect of SS-31 on HG-induced ROS production in MMCs(detected by flow cytometry，n=6).

研究表明，實驗性糖尿病腎病腎小球固有細胞數(shù)量可通過細胞凋亡而減少，并且腎小球系膜細胞凋亡數(shù)與蛋白尿的程度密切相關［13］。高糖誘導的系膜細胞凋亡和系膜缺失是導致糖尿病患者腎臟損傷的一個主要機制［1－2］。高糖能夠明顯誘導體外培養(yǎng)系膜細胞的凋亡，而抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)、二亞苯基碘(DPI)及維生素C能夠明顯抑制高糖誘導的小鼠系膜細胞的凋亡［1］。我們的最近的研究也證實，抗氧化劑tempol以及敲低硫氧還蛋白抑制蛋白(TXNIP)表達均能夠抑制高糖誘導的系膜細胞凋亡［14］。本研究結(jié)果顯示，高糖能夠明顯促進系膜細胞ROS產(chǎn)生，同時伴有細胞凋亡增加，cleaved caspase-3表達和Bax/Bcl-2比率升高以及促使細胞色素C從線粒體釋放入胞質(zhì)。以上提示，高濃度葡萄糖誘導的系膜細胞凋亡和ROS產(chǎn)生密切相關。

Fig 6 Effect of SS-31 on HG-induced activation of p38 MAPK in MMCs(n=6).

SS-31肽是一種線粒體靶向肽，能夠選擇地集中在線粒體內(nèi)膜并降低線粒體ROS產(chǎn)生［6］。最近的研究證實SS-31具有明顯的抗氧化和抗凋亡作用。Thomas等［15］的研究表明，SS-31容易滲入胰島細胞，防止線粒體去極化，減少細胞凋亡，增加胰島細胞數(shù)，改善胰島移植后的功能。在大鼠缺血/再灌注腎損傷模型，SS-31能夠加速細胞ATP恢復，減少腎小管細胞凋亡和壞死，減少氧化應激和炎癥反應，并防止腎小管功能障礙［16］。本研究結(jié)果顯示，SS-31干預能夠抑制HG誘導的MMCs內(nèi)ROS產(chǎn)生，細胞凋亡，cleaved caspase-3表達，Bax/Bcl-2比率和細胞色素C的易位。這些結(jié)果表明，SS-31抑制HG誘導的系膜細胞凋亡可能是通過減少ROS和保護線粒體功能實現(xiàn)的。

p38蛋白激酶(p38 MAPK)為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，是一個重要的信號分子，參與調(diào)控包括細胞凋亡在內(nèi)的許多細胞功能。Jun等［17］的研究顯示，給予FR 167653(一種p38 MAPK抑制劑)，能夠抑制糖尿病腎小球細胞和體外HG誘導的系膜細胞凋亡。我們的研究表明，采用SB203580阻斷p38 MAPK通路能夠明顯抑制HG誘導的系膜細胞凋亡，cleaved caspase-3 表達和 Bax/Bcl-2 比率［14］。以上說明，p38 MAPK信號通路可能與系膜細胞凋亡密切相關。有研究表明N-乙酰半胱氨酸能夠抑制順鉑誘導的腎臟細胞凋亡及p38 MAPK信號通路的活化，提示N-乙酰半胱氨酸的抗凋亡作用可能與抑制p38 MAPK信號通路的活化有關［18］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，SS-31能夠明顯抑制 HG誘導的 p38 MAPK的活化，提示SS-31抑制HG誘導的MMCs凋亡可能部分是通過調(diào)節(jié)p38 MAPK通路活化實現(xiàn)的。

綜上所述，SS-31能夠抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞的凋亡，這種作用可能是通過減少ROS產(chǎn)生，保護線粒體功能以及抑制p38MAPK信號通路的活化實現(xiàn)的。

［1］Kang B P，F(xiàn)rencher S，Reddy V，et al.High glucose promotes mesangial cell apoptosis by oxidant-dependent mechanism ［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2003，284(3):F455－66.

［2］Mishra R，Emancipator S N，Kern T，et al.High glucose evokes an intrinsic proapoptotic signaling pathway in mesangial cells［J］.Kidney Int，2005，67(1):82－93.

［3］Kanwar Y S，Wada J，Sun L，et al.Diabetic nephropathy:mechanisms of renal disease progression［J］.Exp Biol Med(Maywood)，2008，233(1):4－11.

［4］Nishikawa T，Edelstein D，Du X L，et al.Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage［J］.Nature，2000，404(6779):787－90.

［5］Zhao K，Zhao G M，Wu D，et al.Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling，oxidative cell death，and reperfusion injury［J］.J Biol Chem，2004，279(33):34682－90.

［6］Mizuguchi Y，Chen J，Seshan S V，et al.A novel cell-permeable antioxidant peptide decreases renal tubular apoptosis and damage in unilateral ureteral obstruction［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，295(5):F1545－53.

［7］Li J，Chen X，Xiao W，et al.Mitochondria-targeted antioxidant peptide SS31 attenuates high glucose-induced injury on human retinal endothelial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，404(1):349－56.

［8］Huang J，Chuang L，Guh J，et al.Antioxidants attenuate high glucose-induced hypertrophic growth in renal tubular epithelial cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，293(4):F1072－82.

［9］Josephine M F，Melinda T C，Mark E C.Oxidative stress as a major culprit in kidney disease in diabetes［J］.Diabetes，2008，57(6):1446－54.

［10］Onozato M L，Tojo A，Goto A，et al.Oxidative stress and nitric oxide synthase in rat diabetic nephropathy:effects of ACEI and ARB［J］.Kidney Int，2002，61(1):186－94.

［11］楊 曉，李彩蓉，朱忠華，等.EGCG對實驗性糖尿病大鼠腎臟的保護作用［J］.中國藥理學通報，2006，22(1):84－8.

［11］Yang X，Li C R，Zhu Z H，et al.Protective effect of EGCG on experimental diabetic nephropathy in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(1):84－8.

［12］王靜鳳，李曉林，張 珣，等.海參蟲草復劑對糖尿病大鼠腎臟保護作用機制的研究［J］.中國藥理學通報，2010，26(9):1238－42.

［12］Wang J F，Li X L，Zhang X，et al.The mechanism of the mixture of Apostichopus japonicus and Cordyceps militaris on protection of renal injury in diabetic rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(9):1238－42.

［13］Pesce C，Menini S，Pricci F，et al.Glomerular cell replication and cell loss through apoptosis in experimental diabetes mellitus［J］.Nephron，2002，90(4):484－8.

［14］Shi Y，Ren Y，Zhao L，et al.Knockdown of thioredoxin interacting protein attenuates high glucose-induced apoptosis and activation of ASK1 in mouse mesangial cells［J］.FEBS Lett，2011，585(12):1789－95.

［15］Thomas D A，Stauffer C，Zhao K，et al.Mitochondrial targeting with antioxidant peptide SS-31 prevents mitochondrial depolarization，reduces islet cell apoptosis，increases islet cell yield，and improves posttransplantation function ［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(1):213－22.

［16］Szeto H H，Liu S，Soong Y，et al.Mitochondria-targeted peptide accelerates ATP recovery and reduces ischemic kidney injury［J］.J Am Soc Nephrol，2011，22(6):1041－52.

［17］Jung D S，Li J J，Kwak S J，et al.FR167653 inhibits fibronectin expression and apoptosis in diabetic glomeruli and in high-glucosestimulated mesangial cells ［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，295(2):F595－604.

［18］羅景慧，楊迎暴，安田日出夫，等.N-乙酰半胱氨酸影響p38有絲分裂原活化蛋白激酶對順鉑誘導急性腎損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2011，27(2):229－33.

［18］Luo J H，Yang Y B，Hideo Y，et al.Protective effect of N-acetylcysteine on cisplatin-induced acute Kidney injury related to p38MAPK pathway in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(2):229－33.