應(yīng)用DiversiLab系統(tǒng)對肺炎克雷伯菌進(jìn)行同源性分析

李 靜 胡志東 田 彬 徐海茹

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一種常見的革蘭陰性條件致病菌，為醫(yī)院獲得性肺炎及社區(qū)獲得性肺炎的重要病原菌之一。近年來肺炎克雷伯菌的感染率、耐藥性均顯著升高，尤其是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）菌株的增多，已成為肺炎患者死亡的重要原因。目前用于肺炎克雷伯菌的基因分型主要方法是脈沖場凝膠電泳（PFGE）。PFGE是公認(rèn)的細(xì)菌分析分型及同源性分析的金標(biāo)準(zhǔn)，是分型分辨率最高的一種方法，但所需時間較長[1]。Diver?siLab系統(tǒng)是基于細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)（rep-PCR）原理的分型方法，目前國內(nèi)關(guān)于Diversi?Lab系統(tǒng)的相關(guān)報道較少。本研究應(yīng)用DiversiLab系統(tǒng)對8株肺炎克雷伯菌進(jìn)行基因分型，并比較Di?versiLab系統(tǒng)和PFGE兩種分型方法的一致性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 實驗菌株為2010年7月從天津一家甲級醫(yī)院外科同一病房的臨床標(biāo)本中分離，采用常規(guī)方法及VI?TEK-Compact儀器鑒定的8株肺炎克雷伯菌，其臨床資料見表1。（CRO）、頭孢唑林（CFZ）、氨芐西林（AMP）、美羅培南（MEM）、頭孢哌酮/舒巴坦（CPZ/SU）、復(fù)方新諾明（SXT）、哌拉西林/他唑巴坦（PIP/TA）、慶大霉素（GEN）等11種抗菌藥物，為北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。XbaⅠ酶、蛋白酶K購自大連寶生物公司。低熔點瓊脂糖、PFGE瓊脂糖均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。細(xì)菌鑒定儀為法國生物梅里埃公司VITEK-Compact細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。脈沖場凝膠電泳儀為Bio-Rad公司CHEF-DⅢ脈沖場凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司GelDocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)。MOBIO Ultra?Clean（TM）Microbial DNA Isolation kit、rep-PCR DNA finger?printing kit、微流體芯片、Agilent 2100生物分析儀均購自法國生物梅里埃公司。

Table 1 Clinical data of 8 Klebsiella pneumoniae strains表1 8株肺炎克雷伯菌臨床資料

1.3 藥物敏感試驗 采用微量肉湯稀釋法測定菌株對11種抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）2011版標(biāo)準(zhǔn)[2]執(zhí)行。

1.4 DiversiLab系統(tǒng)分子分型 （1）DNA提取。應(yīng)用MOBIO UltraClean（TM）Microbial DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。經(jīng)可見分光光度計（NanoDrop ND-1000）測定，調(diào)整DNA的濃度為25～50 mg/L。（2）rep-PCR擴(kuò)增。應(yīng)用rep-PCR DNA指紋圖譜試劑盒，配制25 μL PCR擴(kuò)增體系：18 μL rep-PCR MM1，2.5 μLGeneAmp10×PCR緩沖液，2.0 μL Primer Mix，0.5 μL AmpliTaq DNA聚合酶，2 μL模板。預(yù)變性94 ℃ 2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，70℃延伸90 s，共35個循環(huán)；最后70℃延伸3 min。（3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測。應(yīng)用微流體芯片和Agilent 2100生物分析儀分離和檢測不同大小和強(qiáng)度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。DiversiLab系統(tǒng)分型技術(shù)評價標(biāo)準(zhǔn)：分析結(jié)果的虛擬凝膠圖像判斷標(biāo)準(zhǔn)參照分為3種，即不可辨別的相似性＞97%，并且沒有條帶差異；相似的相似性＞95%，有1～2條不同的條帶；不同的相似性＜95%，大于2條不同的條帶[3]。DiversiLab系統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)分析原理：DiversiLab version 3.4自帶軟件依據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)分析和計算各樣本的相似性系數(shù)。非加權(quán)組平均數(shù)自動比較rep-PCR產(chǎn)物并創(chuàng)建樹狀圖。數(shù)據(jù)的分析包括樹狀圖、相似性矩陣、電泳圖譜、虛擬凝膠圖像、散點圖和可選擇的相似性數(shù)據(jù)[4]。

1.5 脈沖場凝膠電泳分型 用滅菌棉棒沾取數(shù)個純菌落溶于 2.5 mL TE buffer（10 mmol/LTris-HCl∶1 mmol/L EDTA，pH值8.0）中，配制4.0麥?zhǔn)蠁挝唬?7℃孵育備用。取出150 μL處理好的標(biāo)本，加入20 μL蛋白酶K，30 μL10%十二烷基硫酸鈉（SDS）,終濃度要求1%，混勻56℃預(yù)熱。取2%低熔點膠與處理好的菌液1∶1混合后灌模，室溫下凝固30 min。將成型的膠塊加入到含有5 μL蛋白酶K的1 mL裂解液中，54℃搖床，孵育2 h。然后用50℃預(yù)熱的無菌蒸餾水洗2次，每次10 min，50℃預(yù)熱的TE洗3次，每次10 min。將樣本膠塊取出，切下約2 mm膠塊，浸入含有限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ的200 μL酶切體系中，37℃酶切過夜。將消化好的凝膠塊貼附于制膠梳子末端，置于水平放置的倒膠模具上，將在50℃水浴中平衡的已融化的1%電泳瓊脂糖加入模具中，在室溫凝固30 min。電泳條件為電泳緩沖液0.5×TBE（Tris堿，硼酸，EDTA），切換時間4～30 s，電場強(qiáng)度6 V/cm，溫度14 ℃，電場夾角120°，電泳時間18.5 h，溴化乙錠染色后紫外燈下觀察結(jié)果。PFGE分型技術(shù)的評價標(biāo)準(zhǔn)[5]：（1）同一株。酶切圖譜顯示帶型大小和數(shù)量均相同。（2）緊密相關(guān)型。由于突變、插入、缺失或倒置的遺傳改變在電泳條帶型上與主要表型有3個或3個以下差別的菌株被認(rèn)為是主要型中的亞型。（3）可能相關(guān)。帶型中有4～6條條帶不同被認(rèn)為是不同型別。（4）不相關(guān)。相差7個以上條帶有差異。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感試驗 8株肺炎克雷伯菌中，菌株K8-02與其他7株肺炎克雷伯菌的藥敏譜不盡相同。菌株K8-02對SXT、GEN、MEM、CPZ/SU、CRO、ATM 敏感，對AMC/CA、CIP、CFZ、AMP、PIP/TA 耐藥；菌株1等其他7株肺炎克雷伯菌為多重耐藥菌，對AMC/CA、ATM、CIP、MEM、CPZ/SU、PIP/TA敏感，對CRO、CFZ、AMP、SXT、GEN耐藥，見表2。

Table 2 MIC results of 8 Klebsiella pneumoniae strains表2 8株肺炎克雷伯菌的MIC測定結(jié)果 （mg/L）

2.2 DiversiLab系統(tǒng)分型 DiversiLab將8株肺炎克雷伯菌分成3組，K8-02號單獨為1組，K8-05、K8-04和K8-08相似性＞97%，為1組；K8-07、K8-06、K8-03和K8-01相似性＞97%，為1組，結(jié)果見圖1。利用DiversiLab分析工具將后2組進(jìn)一步比較，2組的相似度為95.2%，可認(rèn)為是1組，結(jié)果見圖2。從而可得出DiversiLab系統(tǒng)分型結(jié)果為：8株肺炎克雷伯菌可分為2組，K8-02標(biāo)本為1組，其他7株菌為另1組。

2.3 PFGE分析 8株肺炎克雷伯菌臨床菌株染色體DNA經(jīng)酶切后進(jìn)行PFGE，均產(chǎn)生了14～16條片段。結(jié)果顯示，8株肺炎克雷伯菌可分為2組（A、B），其中7株為A型，A1亞型5株（K8-01、K8-03、K8-04、K8-06、K8-08號），A2亞型1株（K8-05號），A3亞型1株（K8-07號）；B型1株（K8-02號），見圖3。

3 討論

3.1 分型方法回顧 為確定感染是否為院內(nèi)感染，追蹤感染源、了解傳播途徑，有必要對分離菌株進(jìn)行流行病學(xué)研究?？考?xì)菌藥敏譜表型分型，雖具有一定的臨床意義，但有時細(xì)菌藥敏譜復(fù)雜，對于確定其來源較為困難。因此無論是確定散發(fā)的還是流行的克隆菌株，基因分型方法的分辨力是分型技術(shù)的重要指標(biāo)。Te Witt等[6]對93株MRSA菌株應(yīng)用Diversi?Lab系統(tǒng)、MLST和PFGE分型，三者的Simpson系數(shù)分別是0.860、0.877和0.905。盡管分辨率不同，但3種方法都常用于MRSA的基因分型。國內(nèi)學(xué)者曲燕燕等[1]將DiversiLab系統(tǒng)用于鮑曼不動桿菌基因分型，得到了很好效果。DiversiLab系統(tǒng)快速，操作簡單，有商品化試劑盒，可用于實驗室流行病學(xué)的分型方法。

3.2 8株肺炎克雷伯菌的感染情況 本研究的8株肺炎克雷伯菌分別分離自某醫(yī)院外科同一病房7月17日—29日半個月期間5例感染患者痰、血液和腹腔引流液標(biāo)本。藥敏試驗顯示，8株菌中除K8-2號菌株外的其他7株菌對11種抗菌藥物具有相同的藥敏譜，DiversiLab系統(tǒng)和PFGE也顯示了這7株菌屬于同一型，此次感染很可能為醫(yī)院感染暴發(fā)。來自患者W的腹腔引流液的K8-02號菌，與同時來自該患者的2份血液和1份痰標(biāo)本的3株菌的藥敏譜不同，并且其PFGE圖譜和DiversiLab系統(tǒng)均顯示無相關(guān)性，為不同的肺炎克雷伯菌克隆株感染。根據(jù)5例患者感染的時間先后，DiversiLab系統(tǒng)提供的分析發(fā)現(xiàn)，患者W最先感染，且與隨后感染的L、H、Y、J患者分離出的肺炎克雷伯菌為同一型，PFGE圖譜也同時顯示出此結(jié)果。因此，患者W很有可能是此次醫(yī)院感染暴發(fā)的傳染源，并通過外源途徑傳染給L、H、Y、J等4例患者。

3.3 DiversiLab系統(tǒng)分析 基于rep-PCR的Diversi?Lab系統(tǒng)是一種標(biāo)準(zhǔn)化和自動化系統(tǒng)，由于采用了標(biāo)準(zhǔn)化操作、高分辨率微流體芯片和熒光檢測系統(tǒng)及統(tǒng)一的數(shù)據(jù)處理軟件，具有較好的可重復(fù)性，操作簡單、快速，并且可用于實驗室長期流行病學(xué)的分型方法，因而已應(yīng)用于鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、分枝桿菌屬等的分子流行病學(xué)研究。其結(jié)果收集和分析處理不受主觀限制，40 min即可分析12例標(biāo)本，操作總共只需6～8 h。結(jié)果具有很高的分辨率，一般條帶達(dá)到10條左右，是一種實時定量檢測方法。但這種方法也存在其缺點，分析時只需要1 μL的微量操作，有時1個氣泡就需要重新分析擴(kuò)增產(chǎn)物，增加了檢測周期和費用。在用芯片檢測時，即使在標(biāo)本不足的情況下，12個加樣孔和1個標(biāo)準(zhǔn)孔中也必須加入標(biāo)志物和凝膠熒光染料混合物，造成試劑浪費和成本增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，DiversiLab系統(tǒng)具有操作簡便快速，高重復(fù)性和高分辨率，結(jié)果的定量處理和多種形式輸出等優(yōu)點，將來如果擴(kuò)大樣本量對此方法進(jìn)行方法學(xué)評估，其有可能作為分型鑒定的首選工具，尤其對短期內(nèi)暴發(fā)流行時大量標(biāo)本檢測具有明顯優(yōu)勢。

Figure 1 DiversiLab results of 8 Klebsiella pneumoniae strains圖1 8株肺炎克雷伯菌DiversiLab系統(tǒng)分型結(jié)果

Figure 2 DiversiLab results of 7 Klebsiella pneumoniae strains except for K8-02 specimen圖2 剔除K8-02號標(biāo)本，其他7株肺炎克雷伯菌DiversiLab系統(tǒng)分型結(jié)果

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