RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定布渣葉中牡荊苷和異牡荊苷的含量Δ

孫冬梅，譚志燦，畢曉黎，羅文匯（.廣東省中醫(yī)研究所，廣州50095；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州50405）

布渣葉為椴樹科植物破布葉Microcos paniculata L.的干燥葉[1]，產(chǎn)于廣東、廣西、海南、云南等地，印度、印度尼西亞亦有分布；在我國，尤以兩廣地區(qū)資源豐富，其中廣東的陽西、湛江為主產(chǎn)地，均以野生為主。本品味微酸，性涼，無毒，具有清熱利濕、健胃消滯的功效，用于治療感冒發(fā)熱、黃疸、食欲不振、消化不良、脘腹脹痛、泄瀉、瘡瘍、蜈蚣咬傷等[2-4]。布渣葉的藥用歷史最早見于清·何克諫所著的嶺南本草書籍《生草藥性備要》，載曰：“味酸，性平，無毒，解一切蠱脹，清黃氣，消熱毒。作茶飲，去食積。又名布渣”。

布渣葉主要含有黃酮、生物堿、有機(jī)酸、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、酚類等成分[5-11]。其中的黃酮苷類具有多方面的生物活性，如抗脂質(zhì)過氧化、抗衰老、清除自由基、降低血脂及血膽固醇、抗菌消炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫功能等。牡荊苷和異牡荊苷是含量較高的黃酮碳苷，具有降血壓、止痙攣、抗感染、抗腫瘤、抗菌、輻射保護(hù)以及清除自由基的作用[12-15]，故可以作為布渣葉藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)。牡荊苷和異牡荊苷分子中含有許多酚羥基，極性較大，并且是同分異構(gòu)體，極性相似，不易分離。目前，采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定布渣葉中牡荊苷和異牡荊苷的研究未見報(bào)道，現(xiàn)行版《中國藥典》也僅以牡荊苷作為布渣葉含量測(cè)定的指標(biāo)。因此，本試驗(yàn)建立了布渣葉藥材中牡荊苷和異牡荊苷的HPLC含量測(cè)定方法，并對(duì)不同產(chǎn)地、不同采收期布渣葉中牡荊苷和異牡荊苷進(jìn)行含量分析，為有效控制藥材質(zhì)量及合理利用植物資源提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，含二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、四元梯度泵、G2170 AA數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)（美國Agilent公司）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205 DU型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥材

布渣葉（樣品來源見表1），經(jīng)廣東省中醫(yī)研究所劉法錦教授鑒定為椴樹科植物破布葉M.paniculata L.的干燥葉。

表1 布渣葉樣品來源Tab 1 Sample source of M.paniculata

1.3 試劑

牡荊苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111687-200602）；異牡荊苷對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：Y-127-110705，純度≥98%）；甲醇為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO Capcell pak MG C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%甲酸溶液（30∶70，V/V）；檢測(cè)波長：339 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取牡荊苷和異牡荊苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加70%甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為133.40、184.70μg/ml的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號(hào)篩）約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：200 W，頻率：40 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25ml，分別置25 ml量瓶中，加入70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得牡荊苷質(zhì)量濃度分別為5.34、26.68、53.36、80.04、106.72、133.40μg/ml和異牡荊苷質(zhì)量濃度分別為7.39、36.94、73.88、110.82、147.76、184.70μg/ml的系列溶液。精密吸取上述系列溶液各10 μl注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y牡荊苷＝2.6418 x+3.0268（r＝0.9999，n＝6）、y異牡荊苷＝2.6962 x－5.1328（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，牡荊苷和異牡荊苷的進(jìn)樣量分別在53.40～1334.00、73.90～1847.00ng范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液（牡荊苷20.40μg/ml、異牡荊苷20.10μg/ml）10μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，牡荊苷和異牡荊苷峰面積的RSD分別為0.29%和0.47%（n均為6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（S7）10μl，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，牡荊苷和異牡荊苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為0.41%和0.37%（n均為7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批布渣葉樣品（S30）適量，共6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中牡荊苷和異牡荊苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果，牡荊苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.068%，RSD＝0.89%（n＝6）；異牡荊苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.141%，RSD＝0.92%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)（牡荊苷為0.068%，異牡荊苷為0.141%）的布渣葉樣品（S30）9份，每份約1.25 g，精密稱定，分別精密加入一定質(zhì)量濃度的牡荊苷和異牡荊苷混合對(duì)照品溶液50 ml，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果分別見表2、表3。

表2 牡荊苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test of vitexin（n＝9）

表3 異牡荊苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery test of isovitexin（n＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同來源的布渣葉樣品適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品中牡荊苷和異牡荊苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4；色譜見圖1。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 4 Results of content determination of sample

3 討論

3.1 供試品溶液的制備

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

試驗(yàn)比較了以50%、70%、100%甲醇及70%乙醇4種不同溶劑對(duì)布渣葉藥材進(jìn)行超聲處理后所得牡荊苷和異牡荊苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，采用70%甲醇提取效果較好，而且能很好地減少布渣葉中葉綠素等雜質(zhì)對(duì)色譜柱的污染。在此基礎(chǔ)上比較了回流提取和超聲處理的效率，結(jié)果顯示2種提取方法無顯著性差異，因此選擇操作較方便的超聲提取法。另外，比較了超聲時(shí)間和固液比對(duì)提取效果的影響，結(jié)果顯示超聲處理1 h、固液比為1∶20（m/V）時(shí)，牡荊苷和異牡荊苷基本能夠提取完全。

3.2 檢測(cè)波長的選擇

采用DAD進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)牡荊苷和異牡荊苷均在339 nm波長附近有最大吸收，因此選定339 nm為檢測(cè)波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇[16-19]

試驗(yàn)比較了甲醇-甲酸、甲醇-乙酸、甲醇-磷酸3種流動(dòng)相系統(tǒng)，以及不同的流動(dòng)相比例，并考察了不同甲酸濃度對(duì)牡荊苷和異牡荊苷色譜行為的影響。結(jié)果表明，以甲醇-0.4%甲酸溶液（30∶70，V/V）作為流動(dòng)相為佳，此時(shí)牡荊苷和異牡荊苷均能達(dá)到基線分離，且峰形對(duì)稱。

3.4 色譜柱的考察

試驗(yàn)分別考察了不同廠家的色譜柱[Waters XbridgeTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SHISEIDO Capcell pak MG C18（250 mm×4.6mm，5μm）、Merck Hibar Purospher Star RP-18 e（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agela Venusil ASB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]對(duì)牡荊苷和異牡荊苷的分離效果。結(jié)果表明，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，SHISEIDO Capcell pak MG C18（250mm×4.6mm，5μm）和Merck Hibar Purospher Star RP-18 e（250 mm×4.6 mm，5 μm）均能使牡荊苷和異牡荊苷色譜峰達(dá)到基線分離。由于采用Merck色譜柱時(shí)牡荊苷和異牡荊苷出峰時(shí)間延遲，因此選用SHISEIDO Capcell pak MG C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱。

3.5 質(zhì)量分析

布渣葉中牡荊苷和異牡荊苷2種黃酮碳苷均具有較強(qiáng)的生物活性，因此以牡荊苷和異牡荊苷為指標(biāo)，結(jié)合藥材的外觀性狀、產(chǎn)量及當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境條件建立藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)，更具科學(xué)性。

研究結(jié)果表明，布渣葉中牡荊苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的樣品，異牡荊苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也相對(duì)較高；同一樣品的2種黃酮碳苷中，以異牡荊苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

不同產(chǎn)地布渣葉中2種黃酮碳苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異，其中以廣東陽西古井、肇慶鼎湖山和雷州等產(chǎn)地的布渣葉牡荊苷和異牡荊苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，而廣東博羅等地的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。市場(chǎng)流通的布渣葉飲片中牡荊苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)到0.259%，最低為0.025%；異牡荊苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)到0.421%，最低為0.054%，其中牡荊苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大部分能達(dá)到現(xiàn)行《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。影響2種黃酮碳苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的因素可能與藥材生長的環(huán)境（光照、氣候、土壤等）有關(guān)，同時(shí)藥材采收的時(shí)節(jié)、干燥的方法、貯藏和養(yǎng)護(hù)的條件等因素也可能對(duì)此有影響。

綜上，本方法重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為布渣葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)和資源利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

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[2]廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第一冊(cè)[S].廣州：廣東科技出版社，2004：66.

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