結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)因素對黃酮類化合物抗氧化活性作用的影響

申玉莉，劉宏，喻晶（.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，武漢430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢430065）

活性氧自由基與疾病的關(guān)系十分密切。近年來，對自由基和抗氧劑的研究成為了熱點(diǎn)。黃酮類化合物是研究較多的一類，黃酮類化合物抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)（見圖1）的變化有密切的關(guān)聯(lián)，包括C環(huán)三碳鏈的氧化程度、C3位是否有羥基取代以及B環(huán)連接的位置等對黃酮類化合物的生理活性都有一定的影響。除此之外，黃酮類化合物抗氧化活性也隨著其在機(jī)體內(nèi)的存在形態(tài)、濃度以及體系內(nèi)氧環(huán)境等非結(jié)構(gòu)因素的變化而變化?，F(xiàn)今已有較多試驗(yàn)報(bào)道黃酮類化合物抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)的密切關(guān)系，然而關(guān)于結(jié)構(gòu)以外的因素對黃酮抗氧化活性作用的報(bào)道在國內(nèi)尚不多見。本文將從黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)因素兩大方面對其清除自由基抗氧化活性的影響進(jìn)行綜述。

圖1 黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)

1 結(jié)構(gòu)因素

影響黃酮類化合物抗氧化活性的結(jié)構(gòu)因素主要有：羥基數(shù)目及位置、C環(huán)共軛體系、羥基成苷或甲基化、化合物的脂溶性大小、電荷的分布等。本文將著重討論酚羥基對黃酮類化合物抗氧化活性的影響。黃酮類化合物抗氧化活性作用的機(jī)制主要是通過酚羥基與氧自由基反應(yīng)形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，而酚羥基是黃酮類化合物最主要的官能團(tuán)，其數(shù)目和取代位置的改變都會影響黃酮類化合物的生理活性。

1.1 羥基的作用及影響

黃酮類化合物的B環(huán)是抗氧化和清除自由基的主要活性部位，B環(huán)上的酚羥基是清除活性氧自由基的決定性因素，尤其是B環(huán)上的3′，4′位鄰二酚結(jié)構(gòu)大大提高了黃酮類化合物對脂質(zhì)過氧化的抑制能力，是有效清除過氧化氫、超氧化物以及過氧亞硝基陰離子自由基的顯著特征[1-2]。例如槲皮素和桑色素，二者僅在B環(huán)的結(jié)構(gòu)上有差別，即槲皮素B環(huán)上為鄰二酚羥基取代，桑色素為間二酚取代，但槲皮素的抗氧化活性明顯高于桑色素，原因是黃酮類化合物與自由基反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生了新的基團(tuán)——苯氧自由基。苯氧自由基與鄰位酚羥基形成了分子內(nèi)氫鍵，使未成鍵電子與部分質(zhì)子化了的氫原子之間相互吸引，使自由基結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[3]。另外推測，當(dāng)形成苯氧自由基時(shí)，相鄰酚羥基的C—O鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，形成了共振的半醌式結(jié)構(gòu)[4]，從而中斷游離自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，未成對電子的電子云在半醌式結(jié)構(gòu)中的分布更分散，因而更穩(wěn)定。鄰二酚羥基的這種高活性源于其形成鄰苯醌型結(jié)構(gòu)的共振作用，并已得到量子化學(xué)計(jì)算的證實(shí)。由此可推測出具有聯(lián)苯三酚結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物活性比含鄰二酚結(jié)構(gòu)的活性更高，因?yàn)榍罢咧虚g的羥基脫氫后能形成兩個(gè)分子內(nèi)氫鍵，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

相關(guān)研究也證明，B環(huán)上的鄰二酚羥基是清除超氧陰離子（O－2）的主要部位。Harris GK等[5]在對木犀草素和白楊素清除自由基和抑制環(huán)氧酶-2表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，木犀草素的抗氧化活性遠(yuǎn)大于白楊素，且能有效地清除羥自由基（·OH）和O－2，而白楊素并不能清除O－2，且清除·OH的活性不及木犀草素，二者的結(jié)構(gòu)區(qū)別僅在B環(huán)，這證實(shí)了B環(huán)3′，4′鄰二酚羥基是清除O－2的主要部位。

A環(huán)羥基取代對黃酮類化合物抗氧化活性也有一定的作用[6]。如C5位羥基的抗氧化活性，使染料木黃酮具有與維生素E等同的抗氧化活性，以及較高的清除過氧亞硝基陰離子自由基的能力。5，7-間二酚結(jié)構(gòu)的存在能增加黃酮類化合物的抗氧化能力，但是6-羥基甲基化后并沒有影響黃酮類化合物抑制Fe、抗壞血酸以及CCl4誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化。與B環(huán)羥基取代相比，A環(huán)羥基取代的抗氧化活性還有待商榷。

C環(huán)C3位羥基的活性作用有爭議，有學(xué)者認(rèn)為C3位的羥基為醇羥基，與酚羥基相比較穩(wěn)定，不易失電子，對抗氧化活性意義不大。但有試驗(yàn)表明，C環(huán)上的C3位羥基是抗氧化活性的重要部位，因?yàn)榻怆xC3位羥基上的質(zhì)子所需能量最低，形成的自由基較為穩(wěn)定，抗氧化活性較高，C3位羥基的缺失會導(dǎo)致抗氧化活性的降低[7]。Burda S等[8]也認(rèn)為，黃酮類化合物清除自由基是依賴C環(huán)C3位羥基的存在。具有3位羥基以及B環(huán)鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物的抗過氧亞硝基陰離子自由基的活性，比某些活性氮清除劑的活性要高出10倍以上；槲皮素抑制金屬和非金屬誘導(dǎo)的氧化損傷的優(yōu)勢部分也歸因于其3位羥基的存在，因?yàn)镃3位羥基能增加黃酮自由基的穩(wěn)定性。

一般認(rèn)為，黃酮類化合物與自由基反應(yīng)的主要機(jī)制是酚羥基解離出氫質(zhì)子，氫質(zhì)子與活性氧自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定的分子，從而使自由基失去氧化能力，由此有人推測酚羥基個(gè)數(shù)越多，黃酮類化合物抗氧化活性作用越強(qiáng)，但從理論計(jì)算并不完全支持這種說法。吳洪等[9]對槲皮素解離出羥基的氫質(zhì)子進(jìn)行了量化計(jì)算，結(jié)果顯示，隨著酚羥基數(shù)目的增加，槲皮素解離出質(zhì)子所需的能量也在增加，而且由于空間位阻的影響，需要的能量就更高，而對整個(gè)體系來說，體系能量越低，自由基越穩(wěn)定。因此，不能以酚羥基的多少來衡量黃酮類化合物清除自由基抗氧化的能力。

以上結(jié)果說明，與酚羥基的數(shù)目相比，羥基取代的位置，主要是鄰二酚取代，對黃酮類化合物抗氧化活性的貢獻(xiàn)更大，是黃酮類化合物保持強(qiáng)抗氧化活性所必需的，而酚羥基的數(shù)量并非越多越好。盡管評價(jià)黃酮類化合物活性的方法不盡相同，但是對于羥基使黃酮類化合物具有很強(qiáng)的清除自由基的能力的觀點(diǎn)得到了廣泛的認(rèn)同。

1.2 共軛結(jié)構(gòu)的影響

C環(huán)C2與C3之間雙鍵與C4位羰基的存在延長了A、B環(huán)共軛體系，促進(jìn)了電子離域的形成，有助于黃酮類化合物供氫后形成相對穩(wěn)定的自由基中間體，提高了抗氧化能力[10]；但雙鍵氫化后，這種延長的共軛體系被打斷，改變了分子的平面結(jié)構(gòu)，其抗氧化活性降低。如槲皮素與兒茶素，二者具有相同的羥基排布，但槲皮素的C環(huán)含C2與C3與雙鍵和C4位羰基，這種結(jié)構(gòu)使它的抗氧化活性遠(yuǎn)高于含飽和C環(huán)的兒茶素[11]。

B環(huán)與分子的其余部分的扭轉(zhuǎn)角度，對黃酮類化合物清除自由基的能力也有較大影響[12]。若將B環(huán)繞C2-C1′鍵旋轉(zhuǎn)并分別做能量計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，C環(huán)與B環(huán)在同一平面時(shí)體系能量最低，相互垂直時(shí)最高[13]。當(dāng)C2、C3間雙鍵存在時(shí)，B環(huán)借助雙鍵與C環(huán)共軛從而使黃酮類化合物整個(gè)分子處于同一平面上，使共軛體系延長，這能增加黃酮類苯氧基的穩(wěn)定性，更有利于抗氧化活性。影響黃酮類化合物平面性的因素除了C2、C3間雙鍵外，C3位上的羥基也起著重要作用。高志強(qiáng)等[13]以木犀草素為模型化合物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，去掉C3位上的羥基取代后，B環(huán)與C環(huán)之間產(chǎn)生了18.7°的扭轉(zhuǎn)角，破壞了分子共面性，使黃酮類化合物清除自由基能力減弱。總之，雖然其他結(jié)構(gòu)因素的影響遠(yuǎn)大于B、C環(huán)共軛體系的影響，但是這種共軛體系的存在使黃酮類化合物清除自由基的活性能力增強(qiáng)。

2 非結(jié)構(gòu)因素

2.1 疏水性的影響

自由基反應(yīng)屬于非離子型反應(yīng)，極性越小越有利于反應(yīng)的進(jìn)行，因此在黃酮類化合物抗氧化反應(yīng)中，油水分配系數(shù)也起著較重要的作用。在一定范圍內(nèi)，疏水參數(shù)大的，即脂溶性強(qiáng)的黃酮類化合物，抗氧化活性較弱[14]。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，疏水參數(shù)與某些基團(tuán)的位置無關(guān)，只與基團(tuán)個(gè)數(shù)有關(guān)；疏水參數(shù)與羥基數(shù)目也有關(guān)系，黃酮類化合物含羥基數(shù)越多，疏水參數(shù)越小，抗氧化活性就越大。

同時(shí)，疏水參數(shù)過大即脂溶性過強(qiáng)，也會影響黃酮類化合物的生物利用度和生物活性?？乱蚝湍鞠菟卦?7℃下的溶解度分別為0.1103、1.716 mg[16]，與木犀草素相比，口服柯因的生物利用度在0.003%～0.02%之間[17]，柯因的抗氧化活性作用不及木犀草素，其低溶解度可能為影響因素之一。

2.2 聚合度的影響

對于黃酮聚合物的抗氧化活性，也有人作出研究探討，但由于聚合反應(yīng)的相對復(fù)雜性和多樣性，關(guān)于聚合物是否比單體黃酮類化合物清除超氧陰離子更有效力的報(bào)道不多。已經(jīng)得到的結(jié)論有：二聚體和三聚體的活性差別不大[18]；四聚物比三聚物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗過氧硝酸鹽以及超氧化物介導(dǎo)的氧化反應(yīng)，而七聚物和六聚物比三聚物和四聚物有更顯著的清除超氧化物特性[19]?？傊?，增加聚合度能提高黃酮類化合物抗多種自由基的效力。而C3位羥基和B環(huán)鄰二酚羥基的存在使聚合物自由基更穩(wěn)定，具有更強(qiáng)的清除自由基活性。

2.3 機(jī)體內(nèi)氧環(huán)境的影響

氧是生命周期中最重要的分子之一，它作為在線粒體氧化磷酸化的終端電子受體并產(chǎn)生活性氧自由基，參與機(jī)體中一系列反應(yīng)，影響體內(nèi)的活性因子，對新陳代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病的分化等有著重要意義。

機(jī)體內(nèi)的氧參與生物反應(yīng)也可產(chǎn)生活性氧自由基，因此體系內(nèi)的氧環(huán)境對自由基的生成和清除存在影響。缺氧條件下，黃酮類化合物抗氧化活性受到抑制，表現(xiàn)出促氧化作用。在研究槲皮素、姜黃素、抗壞血酸等抗氧化劑與谷胱甘肽的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)槲皮素雖然具有抗氧化活性，但在缺氧狀態(tài)下被轉(zhuǎn)化為可能有毒的甲基化醌類化合物，而谷胱甘肽和甲基化醌能形成加合物，可降低甲基化醌類的毒性作用，因此在缺少谷胱甘肽時(shí)甲基化醌類化合物表現(xiàn)毒性作用[20]，說明在缺氧狀態(tài)下槲皮素并不能發(fā)揮抗氧化作用。缺氧環(huán)境下的這種影響可能與黃酮類化合物B環(huán)上的鄰二酚結(jié)構(gòu)有關(guān)，比如缺氧條件下，B環(huán)上具有鄰二酚結(jié)構(gòu)的槲皮素的促氧化性明顯比B環(huán)上只有一個(gè)酚羥基的姜黃素要高[21]。

正常情況下，硫氧還蛋白還原酶（TrxR）還原氧化態(tài)的硫氧還蛋白（Trx），在還原型輔酶Ⅱ（NADPH）存在時(shí)，還原態(tài)的Trx作為硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）的電子供體，將過氧化氫還原為H2O。但是缺氧環(huán)境下，黃酮類化合物轉(zhuǎn)化成的鄰醌和甲基化醌能夠抑制TrxR的活性，可能因?yàn)猷忰?、甲基化醌攻擊還原態(tài)TrxR末端的硒代半胱氨酸，使TrxR結(jié)構(gòu)改變，并抑制了TPX的活性[7]，使機(jī)體清除自由基的能力減弱。

2.4 濃度的影響

一般認(rèn)為黃酮類化合物在機(jī)體內(nèi)的濃度越大，其抗氧化活性就越高，其實(shí)不然。Hirata A等[22]在研究橙皮苷及其苷元抑制環(huán)氧酶的表達(dá)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雖然橙皮苷元抗氧化活性較強(qiáng)，但在濃度超過臨界值時(shí)，濃度的增大并不會明顯提高其清除自由基的活性。

雖然某些黃酮類化合物抗氧化活性較強(qiáng)，但是在高濃度時(shí)，它們通過自氧化和氧化還原反應(yīng)會產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，使抗氧化活性降低，反而會產(chǎn)生細(xì)胞毒性甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Watjen W等[23]在大鼠肝癌細(xì)胞上測試了7種黃酮類化合物對過氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物的藥理學(xué)活性和體外抗氧化能力沒有明確的關(guān)聯(lián)，但是與細(xì)胞攝入黃酮類化合物的量有關(guān)。其中，槲皮素和漆樹黃酮容易被細(xì)胞攝入，在低至10～25 μmol/L的濃度時(shí)，即可檢測到它們的抗過氧化氫活性，包括抑制DNA鏈的斷裂，以及對細(xì)胞凋亡的防護(hù)作用；另一方面，濃度在50～250 μmol/L的范圍時(shí)這些黃酮類化合物反而會誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，促使DNA鏈斷裂，寡核苷酸DNA分裂，使蛋白酶激活，蛋白質(zhì)水解。已報(bào)道的人體內(nèi)槲皮素藥動學(xué)數(shù)據(jù)表明，當(dāng)正常飲食提供1～2 g的槲皮素時(shí)，即可能導(dǎo)致血漿中槲皮素的濃度在10～50 μmol/L之間，而某些黃酮類化合物保護(hù)細(xì)胞的濃度僅僅比它們引起DNA損傷以及促使細(xì)胞凋亡的濃度低5～10 μmol/L，因此通過飲食控制黃酮類化合物的攝入是有必要的。

2.5 協(xié)同作用的影響

人體內(nèi)內(nèi)源性的抗氧化劑，如抗壞血酸、維生素E、有關(guān)的酶系統(tǒng)（如超氧化物歧化酶）等，通常會與黃酮類化合物發(fā)生相互作用，協(xié)同減少氧自由基所致的損傷。

Kadoma Y等[24]使用氧化誘導(dǎo)期法，研究抗壞血酸、維生素E與黃酮類化合物的協(xié)同作用，發(fā)現(xiàn)兒茶素和表兒茶素與δ-維生素E的誘導(dǎo)時(shí)間比相應(yīng)的計(jì)算值大，預(yù)示著黃酮類化合物與δ-維生素E具有協(xié)同作用。在協(xié)同過程中，維生素E在聯(lián)合抗氧化劑的作用下部分再生，推動再生過程的是協(xié)同反應(yīng)中半醌自由基被清除，因?yàn)榘膈杂苫^穩(wěn)定，其存在使維生素E的再生不可逆[25]。但是，兒茶素和表兒茶素與α-、β-、γ-維生素E的誘導(dǎo)時(shí)間比相應(yīng)的計(jì)算值要小，推測兒茶素和表兒茶素的抗氧活性可能隨著α-、β-、γ-維生素E的增加而減弱。有分歧的是，有試驗(yàn)[26]表明α-維生素E與兒茶素、表兒茶素具有協(xié)同作用，可能機(jī)制為黃酮類化合物能減少α-維生素E自由基的產(chǎn)生，使維生素E再生，發(fā)揮抗氧化作用，而被氧化了的黃酮類化合物又可被谷胱甘肽和抗壞血酸重新還原，繼續(xù)發(fā)揮抗氧化作用。在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸能使兒茶素避免被氧化，這可能是聯(lián)合抗氧化劑的協(xié)同作用使氧化還原反應(yīng)滯后所致[27]。

但是也有研究發(fā)現(xiàn)，在體外脂蛋白氧化模型中，黃酮類化合物與抗壞血酸協(xié)同反應(yīng)會降低二者的抗氧化活性[28]，這可能與抗壞血酸衍生物（ASDB）有關(guān)，ASDB與黃酮類化合物無協(xié)同抗氧化作用，反而會引發(fā)黃酮類化合物的促氧化作用。

在黃酮類化合物與其他抗氧化劑的相互作用中，雖然大部分表現(xiàn)出共同抗氧化作用，但受各種因素的影響，有時(shí)也會表現(xiàn)出促氧化作用，這可能與體系環(huán)境、抗氧化劑的結(jié)構(gòu)與自由基的種類有關(guān)。

3 小結(jié)

黃酮類化合物是一類優(yōu)良的天然抗氧化劑，其各種生物活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密不可分。因此，了解了黃酮類化合物抗氧化、清除自由基的構(gòu)效關(guān)系以及影響因素，就可以通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的方法改善黃酮類化合物現(xiàn)有結(jié)構(gòu)弱點(diǎn)，增強(qiáng)其生物學(xué)活性，同時(shí)結(jié)合非結(jié)構(gòu)因素對其活性的影響，科學(xué)合理地使用黃酮類化合物，達(dá)到事半功倍的效果。盡管現(xiàn)有的研究表明，黃酮類化合物在清除自由基、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等方面有良好的作用，但其在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)制、藥理作用靶點(diǎn)尚不明確，有待進(jìn)一步研究和探索。

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