梁英健, 李 鑫, 張曉娟, 劉志永, 馬曉春
(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科,遼寧沈陽110001)
膿毒癥的發(fā)生發(fā)展打破了機體細胞增生和死亡之間的精確平衡,細胞凋亡的變化是病原體和宿主之間相互作用的結果。近年來研究顯示細胞凋亡變化是膿毒癥重要的病理變化之一[1]。膿毒癥時免疫細胞和組織細胞的凋亡發(fā)生異常與病程和預后密切相關,同時糾正凋亡異常的治療措施逐漸發(fā)展并且在動物實驗中也取得了很好的療效[2]。內(nèi)皮系統(tǒng)功能失調(diào)是膿毒癥器官衰竭和死亡的一個重要特征,從細胞水平上說這種內(nèi)皮功能喪失主要是由于內(nèi)皮細胞凋亡的增加[1]。核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)作為一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子,在細胞凋亡中同樣具有重要的作用。本文就NF-κB在膿毒癥引起的內(nèi)皮損傷和細胞凋亡中的作用做進一步的探討。
選取2008年6月~2008年11月在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科住院治療的腹腔感染患者22名,其中男性13名,女性9名。年齡36~90歲,平均(65.7±13.9)歲。對照組為8 名健康者,男性5名,女性3名,年齡(60.2±11.3)歲。所有患者均符合美國胸科醫(yī)師學會和危重病學會提出的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)診斷標準的全部或至少2項。每名患者在發(fā)生膿毒癥24 h內(nèi)采血10 mL,對照組每名采血5 mL。枸櫞酸鈉抗凝,4℃ 1 000 r/min 15 min,獲得血漿。分裝后-70℃保存。每個病例都填寫了知情同意書。
2.1 內(nèi)皮細胞的培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自復旦大學醫(yī)學部。細胞復蘇后于20%胎牛血清的DMEM(Gibco)培養(yǎng)液中傳代,所有實驗細胞在體外擴增均不超過15代。
2.2 膿毒癥血漿刺激HUVECs上清液的制備 HUVECs經(jīng)胰蛋白酶消化后,調(diào)整細胞數(shù)為5×108/L,種植于24孔板中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36~48 h,再換用無酚紅無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,使細胞同步于G0期。陰性對照組分別加入10%、20%和30%正常人血漿;實驗組分別加入10%、20%和30%膿毒癥患者血漿;拮抗劑組加入NF-κB拮抗劑PDTC(Sigma)100μmol/L,1 h后再加入20%膿毒癥患者血漿,收集上清液,1000 r/min,離心10 min),分裝,-70℃凍存。
2.3 ELISA應用ELISA方法檢測von Willebrand因子(von Willebrand factor,vWF)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)。人 vWF 的 ELISA試劑盒購自ADL,人TNF-αELISA試劑盒購自晶美生物工程有限公司。具體方法嚴格按說明書進行。每組樣品做3孔。
2.4 免疫熒光 將制成的細胞懸液種植于由0.2%明膠包被的玻片上,培養(yǎng)24 h;換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,使細胞同步于G0期。實驗組加入20%膿毒癥患者血漿,拮抗劑組在加入血漿前1 h加入PDTC 100μmol/L;經(jīng)過4%多聚甲醛固定,0.2%Triton X-100打孔,3%BSA封閉后,加入30μL I抗NF-κB抗體,4℃過夜;PBS沖洗干凈,加入30μL TRITC標記的II抗(北京中杉生物試劑有限公司),37℃孵育1 h;在熒光顯微鏡下拍照。
2.5 MTT比色法 HUVECs經(jīng)胰蛋白酶消化后制成細胞懸液,以5×103cells/well的細胞數(shù)接種于96孔板中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36~48 h,再換用無酚紅無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,使細胞同步于G0期。實驗組加入10%膿毒癥血漿;拮抗劑組加入二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 和 200 μmol/L)作用1 h后,再加入10%膿毒癥血漿作用18 h;陰性對照組為正常的HUVECs。每個實驗組設3個平行孔。每孔加入20μL無菌MTT(5 g/L)孵育4 h,再加入150μL DMSO,于微量振蕩器充分振蕩10 min,用酶標儀于490 nm波長條件下測定吸光度值。
2.6 流式細胞術 培養(yǎng)瓶中細胞基本融合后,加入無血清DMEM作用24 h;實驗組加入10%膿毒癥血漿;拮抗劑組加入PDTC 100μmol/L 1 h后,再加入10%膿毒癥血漿,作用18 h;制成細胞懸液并收集于離心管中,2 000 r/min離心5 min,棄上清;PBS洗滌細胞2次后再次2 000 r/min離心5 min,棄上清;依次加入500μL binding buffer、5μL AnnexinV-FITC 和5μL碘化丙啶(propidium iodide,PI);混勻后過濾;室溫、避光、反應5~15 min,1 h內(nèi)在流式細胞儀檢測。Annexin V+/PI-為凋亡細胞。
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。組間差異采用One-way ANOVA和SNK-q檢驗分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
膿毒癥患者血中TNF-α和vWF明顯高于正常人(P<0.01),表明膿毒癥患者存在內(nèi)皮細胞損傷,見表1。
表1 vWF和TNF-α在膿毒癥患者和正常人中的檢測Table 1.The concentrations of plasma TNF-α and vWF in septicpatients and healthy controls(Mean±SEM.n=3)
分別用10%、20%和30%膿毒癥患者血漿刺激HUVECs,10%、20%和30%正常人血漿做陰性對照,膿毒癥患者血漿刺激HUVECs釋放vWF在120 min達到高峰,隨之下降。10%、20%和30%膿毒癥患者血漿刺激HUVECs均可引起vWF的升高,30%膿毒癥患者血漿引起內(nèi)皮細胞損傷最強。在10~120 min內(nèi),vWF和TF的升高與膿毒癥血漿呈時間-劑量依賴關系,見圖1。
Figure 1.Increased production of vWF from HUVECs treated with septic plasma(SP).NP:normal plasma.Mean±SEM.n=3.*P <0.05,**P <0.01 vs NP at the same concentration.圖1 膿毒癥患者血漿引起vWF升高
用20%膿毒癥患者血漿刺激HUVECS,應用免疫熒光的方法觀察NF-κB活化。在10 min時即可看見NF-κB的活化(由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核),30 min達到高峰,見圖2。
Figure 2.Septic plasma(SP)activated NF-κB in HUVECs.A:control;B:20%SP for 10 min;C:20%SP for 30 min.Mean ±SD.n=3.**P <0.01 vs A.圖2 膿毒癥患者血漿刺激HUVECs后NF-κB活化
在膿毒癥患者血漿刺激HUVECs之前加入NF-κB拮抗劑PDTC,PDTC的濃度為100μmol/L時,細胞活力受到明顯影響,見圖3。在加入20%膿毒癥患者血漿刺激HUVECs之前1 h加入NF-κB拮抗劑PDTC 100μmol/L,可以看到PDTC抑制了HUVECs中vWF的升高,表明NF-κB參與膿毒癥的內(nèi)皮損傷,見圖4。
Figure 3.The viability of HUVECs treated with septic plasma(SP)and pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)determined by MTT.Mean±SEM.n=3.*P <0.05 vs control;#P <0.05,##P <0.01 vs 20%SP.圖3 MTT比色法檢測PDTC濃度
Figure 4.Effects of NF-κB inhibitor PDTCon of vWFproduction in HUVECs treated with septic plasma(SP).Mean±SEM.n=3.*P <0.05,**P <0.01 vs20%SP.圖4 加入NF-κB拮抗劑后vWF的變化
加入NF-κB拮抗劑PDTC 100μmol/L 1 h后再分別加入10%膿毒癥患者血漿和10%正常人血漿作用HUVECs 18 h,對照組HUVECs凋亡率為(4.39±0.12)%;10%正常人血漿作用18 h HUVECs凋亡率為(4.85±0.13)%;10%膿毒癥患者血漿作用18 h ,HUVECs凋亡率增加至(10.79 ±0.14)%;加入NF-κB 拮抗劑 PDTC18 h,HUVECs凋亡率增加至(16.03 ±0.12)%,見圖5。
Figure 5.Effects of differents factors on apoptosis of HUVECs at 18 h.A:control;B:10%normal plasma for 18 h;C:10%septic plasma for 18 h;D:100μmol/L PDTC for 1 h and 10%septic plasma for 18 h.圖5 不同因素作用18 h對HUVECs凋亡的影響
膿毒癥的早期即有內(nèi)皮細胞的活化和損傷,在膿毒癥病人引發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的過程中,內(nèi)皮細胞的活化-損傷起了重要的作用[3]。vWF存在于血管內(nèi)皮細胞的 Weibel-Palade小體、血漿和血小板α顆粒中,當血管內(nèi)皮細胞受損時,vWF等內(nèi)容物釋放入血增多,因此vWF是反映內(nèi)皮細胞受損的重要標記物,其水平高低可反映血管內(nèi)皮受損嚴重程度[4]。我們檢測了膿毒癥患者血漿以及用膿毒癥患者血漿刺激HUVECs后vWF的濃度,發(fā)現(xiàn)vWF均明顯升高,表明膿毒癥時存在內(nèi)皮細胞的損傷。
為了明確膿毒癥時影響內(nèi)皮損傷的炎癥介質(zhì),我們檢測了TNF-α。TNF-α處于眾多炎癥因子中的核心地位,能夠刺激其它各種促炎癥細胞因子的生成[5]。NF-κB、AP-1、ATF-2 等都是能與 TNF-α 基因啟動子和增強子結合而促進轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子[6]。它們的活化都依賴于p38的活化。同時TNF-α的活化又進一步激活各種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子,激活炎癥細胞,兩者互為因果,進而形成炎癥級聯(lián)反應,造成炎癥介質(zhì)泛濫。膿毒癥血漿富含細胞因子,化學因子和其它炎癥介質(zhì)[7],TNF-α是其中主要物質(zhì)之一。本實驗中22名膿毒癥病人的血漿中TNF-α明顯高于健康對照者[(155.68 ±89.74)ng/L vs(5.00 ±0.47)ng/L,P <0.01],進一步驗證了 TNF-α 是影響內(nèi)皮細胞損傷的主要炎癥介質(zhì)。
為進一步明確膿毒癥發(fā)生內(nèi)皮細胞損傷和凋亡的分子機制,我們檢測了NF-κB途徑。NF-κB與細胞凋亡的關系密切,其參與多種凋亡相關基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[8]。NF-κB 的活化核轉(zhuǎn)錄是通過 IKK/NF-κB途徑進行的[9-10]。靜息狀態(tài)下,細胞質(zhì)中的p50/p65與IKB結合成三聚體,使p50/p65不能核移位。當受到菌血癥和內(nèi)毒素等刺激后,IκB發(fā)生磷酸化和降解,使NF-κB成為具有活性的形式并迅速發(fā)生核移位,在細胞核中尋找特定靶基因啟動子區(qū)的κB位點并與之結合,指導下游基因表達調(diào)控[9]。本實驗中用膿毒癥血漿刺激HUVECs,NF-κB活化,從胞漿移位入胞核,應用NF-κB拮抗劑PDTC阻斷時,vWF降低,表明NF-κB參與了膿毒癥的內(nèi)皮細胞損傷。應用流式細胞儀檢測細胞凋亡,加入NF-κB拮抗劑PDTC后,HUVECs凋亡增加,表明NF-κB在膿毒癥血漿引起的內(nèi)皮細胞凋亡中起抑制凋亡的作用。
在膿毒癥中存在內(nèi)皮細胞損傷,內(nèi)皮細胞凋亡增加,NF-κB在膿毒癥引起的內(nèi)皮細胞損傷和凋亡中起重要作用。