NF-κB在膿毒癥血漿誘導的內(nèi)皮細胞損傷和凋亡中的作用*

梁英健， 李 鑫， 張曉娟， 劉志永， 馬曉春

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，遼寧沈陽110001)

膿毒癥的發(fā)生發(fā)展打破了機體細胞增生和死亡之間的精確平衡，細胞凋亡的變化是病原體和宿主之間相互作用的結(jié)果。近年來研究顯示細胞凋亡變化是膿毒癥重要的病理變化之一［1］。膿毒癥時免疫細胞和組織細胞的凋亡發(fā)生異常與病程和預(yù)后密切相關(guān)，同時糾正凋亡異常的治療措施逐漸發(fā)展并且在動物實驗中也取得了很好的療效［2］。內(nèi)皮系統(tǒng)功能失調(diào)是膿毒癥器官衰竭和死亡的一個重要特征，從細胞水平上說這種內(nèi)皮功能喪失主要是由于內(nèi)皮細胞凋亡的增加［1］。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)作為一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，在細胞凋亡中同樣具有重要的作用。本文就NF-κB在膿毒癥引起的內(nèi)皮損傷和細胞凋亡中的作用做進一步的探討。

材料和方法

1 膿毒癥患者和健康對照者血漿的獲得

選取2008年6月～2008年11月在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科住院治療的腹腔感染患者22名，其中男性13名，女性9名。年齡36～90歲，平均(65．7±13．9)歲。對照組為8 名健康者，男性5名，女性3名，年齡(60．2±11．3)歲。所有患者均符合美國胸科醫(yī)師學會和危重病學會提出的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)診斷標準的全部或至少2項。每名患者在發(fā)生膿毒癥24 h內(nèi)采血10 mL，對照組每名采血5 mL。枸櫞酸鈉抗凝，4℃ 1 000 r/min 15 min，獲得血漿。分裝后－70℃保存。每個病例都填寫了知情同意書。

2 方法

2．1 內(nèi)皮細胞的培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自復(fù)旦大學醫(yī)學部。細胞復(fù)蘇后于20%胎牛血清的DMEM(Gibco)培養(yǎng)液中傳代，所有實驗細胞在體外擴增均不超過15代。

2．2 膿毒癥血漿刺激HUVECs上清液的制備 HUVECs經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞數(shù)為5×108/L，種植于24孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，再換用無酚紅無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞同步于G0期。陰性對照組分別加入10%、20%和30%正常人血漿;實驗組分別加入10%、20%和30%膿毒癥患者血漿;拮抗劑組加入NF-κB拮抗劑PDTC(Sigma)100μmol/L，1 h后再加入20%膿毒癥患者血漿，收集上清液，1000 r/min，離心10 min)，分裝，－70℃凍存。

2．3 ELISA應(yīng)用ELISA方法檢測von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)。人 vWF 的 ELISA試劑盒購自ADL，人TNF-αELISA試劑盒購自晶美生物工程有限公司。具體方法嚴格按說明書進行。每組樣品做3孔。

2．4 免疫熒光 將制成的細胞懸液種植于由0．2%明膠包被的玻片上，培養(yǎng)24 h;換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞同步于G0期。實驗組加入20%膿毒癥患者血漿，拮抗劑組在加入血漿前1 h加入PDTC 100μmol/L;經(jīng)過4%多聚甲醛固定，0．2%Triton X-100打孔，3%BSA封閉后，加入30μL I抗NF-κB抗體，4℃過夜;PBS沖洗干凈，加入30μL TRITC標記的II抗(北京中杉生物試劑有限公司)，37℃孵育1 h;在熒光顯微鏡下拍照。

2．5 MTT比色法 HUVECs經(jīng)胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，以5×103cells/well的細胞數(shù)接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，再換用無酚紅無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞同步于G0期。實驗組加入10%膿毒癥血漿;拮抗劑組加入二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 和 200 μmol/L)作用1 h后，再加入10%膿毒癥血漿作用18 h;陰性對照組為正常的HUVECs。每個實驗組設(shè)3個平行孔。每孔加入20μL無菌MTT(5 g/L)孵育4 h，再加入150μL DMSO，于微量振蕩器充分振蕩10 min，用酶標儀于490 nm波長條件下測定吸光度值。

2．6 流式細胞術(shù) 培養(yǎng)瓶中細胞基本融合后，加入無血清DMEM作用24 h;實驗組加入10%膿毒癥血漿;拮抗劑組加入PDTC 100μmol/L 1 h后，再加入10%膿毒癥血漿，作用18 h;制成細胞懸液并收集于離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清;PBS洗滌細胞2次后再次2 000 r/min離心5 min，棄上清;依次加入500μL binding buffer、5μL AnnexinV-FITC 和5μL碘化丙啶(propidium iodide，PI);混勻后過濾;室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)在流式細胞儀檢測。Annexin V+/PI－為凋亡細胞。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。組間差異采用One-way ANOVA和SNK-q檢驗分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 膿毒癥患者和正常人血中TNF-α和vWF的變化

膿毒癥患者血中TNF-α和vWF明顯高于正常人(P＜0．01)，表明膿毒癥患者存在內(nèi)皮細胞損傷，見表1。

表1 vWF和TNF-α在膿毒癥患者和正常人中的檢測Table 1．The concentrations of plasma TNF-α and vWF in septicpatients and healthy controls(Mean±SEM．n=3)

2 膿毒癥患者血漿引起的內(nèi)皮細胞損傷呈時間－劑量依賴關(guān)系

分別用10%、20%和30%膿毒癥患者血漿刺激HUVECs，10%、20%和30%正常人血漿做陰性對照，膿毒癥患者血漿刺激HUVECs釋放vWF在120 min達到高峰，隨之下降。10%、20%和30%膿毒癥患者血漿刺激HUVECs均可引起vWF的升高，30%膿毒癥患者血漿引起內(nèi)皮細胞損傷最強。在10～120 min內(nèi)，vWF和TF的升高與膿毒癥血漿呈時間－劑量依賴關(guān)系，見圖1。

Figure 1．Increased production of vWF from HUVECs treated with septic plasma(SP)．NP:normal plasma．Mean±SEM．n=3．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs NP at the same concentration．圖1 膿毒癥患者血漿引起vWF升高

3 膿毒癥患者血漿刺激HUVECs后NF-κB活化

用20%膿毒癥患者血漿刺激HUVECS，應(yīng)用免疫熒光的方法觀察NF-κB活化。在10 min時即可看見NF-κB的活化(由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核)，30 min達到高峰，見圖2。

Figure 2．Septic plasma(SP)activated NF-κB in HUVECs．A:control;B:20%SP for 10 min;C:20%SP for 30 min．Mean ±SD．n=3．＊＊P ＜0．01 vs A．圖2 膿毒癥患者血漿刺激HUVECs后NF-κB活化

4 NF-κB參與膿毒癥患者血漿引起的內(nèi)皮細胞損傷

在膿毒癥患者血漿刺激HUVECs之前加入NF-κB拮抗劑PDTC，PDTC的濃度為100μmol/L時，細胞活力受到明顯影響，見圖3。在加入20%膿毒癥患者血漿刺激HUVECs之前1 h加入NF-κB拮抗劑PDTC 100μmol/L，可以看到PDTC抑制了HUVECs中vWF的升高，表明NF-κB參與膿毒癥的內(nèi)皮損傷，見圖4。

Figure 3．The viability of HUVECs treated with septic plasma(SP)and pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)determined by MTT．Mean±SEM．n=3．*P ＜0．05 vs control;#P ＜0．05，##P ＜0．01 vs 20%SP．圖3 MTT比色法檢測PDTC濃度

Figure 4．Effects of NF-κB inhibitor PDTCon of vWFproduction in HUVECs treated with septic plasma(SP)．Mean±SEM．n=3．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs20%SP．圖4 加入NF-κB拮抗劑后vWF的變化

5 NF-κB參與了膿毒癥引起的內(nèi)皮細胞凋亡

加入NF-κB拮抗劑PDTC 100μmol/L 1 h后再分別加入10%膿毒癥患者血漿和10%正常人血漿作用HUVECs 18 h，對照組HUVECs凋亡率為(4．39±0．12)%;10%正常人血漿作用18 h HUVECs凋亡率為(4．85±0．13)%;10%膿毒癥患者血漿作用18 h ，HUVECs凋亡率增加至(10．79 ±0．14)%;加入NF-κB 拮抗劑 PDTC18 h，HUVECs凋亡率增加至(16.03 ±0．12)%，見圖5。

Figure 5．Effects of differents factors on apoptosis of HUVECs at 18 h．A:control;B:10%normal plasma for 18 h;C:10%septic plasma for 18 h;D:100μmol/L PDTC for 1 h and 10%septic plasma for 18 h．圖5 不同因素作用18 h對HUVECs凋亡的影響

討 論

膿毒癥的早期即有內(nèi)皮細胞的活化和損傷，在膿毒癥病人引發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的過程中，內(nèi)皮細胞的活化－損傷起了重要的作用［3］。vWF存在于血管內(nèi)皮細胞的 Weibel-Palade小體、血漿和血小板α顆粒中，當血管內(nèi)皮細胞受損時，vWF等內(nèi)容物釋放入血增多，因此vWF是反映內(nèi)皮細胞受損的重要標記物，其水平高低可反映血管內(nèi)皮受損嚴重程度［4］。我們檢測了膿毒癥患者血漿以及用膿毒癥患者血漿刺激HUVECs后vWF的濃度，發(fā)現(xiàn)vWF均明顯升高，表明膿毒癥時存在內(nèi)皮細胞的損傷。

為了明確膿毒癥時影響內(nèi)皮損傷的炎癥介質(zhì)，我們檢測了TNF-α。TNF-α處于眾多炎癥因子中的核心地位，能夠刺激其它各種促炎癥細胞因子的生成［5］。NF-κB、AP-1、ATF-2 等都是能與 TNF-α 基因啟動子和增強子結(jié)合而促進轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子［6］。它們的活化都依賴于p38的活化。同時TNF-α的活化又進一步激活各種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，激活炎癥細胞，兩者互為因果，進而形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)，造成炎癥介質(zhì)泛濫。膿毒癥血漿富含細胞因子，化學因子和其它炎癥介質(zhì)［7］，TNF-α是其中主要物質(zhì)之一。本實驗中22名膿毒癥病人的血漿中TNF-α明顯高于健康對照者［(155．68 ±89．74)ng/L vs(5．00 ±0.47)ng/L，P ＜0．01］，進一步驗證了 TNF-α 是影響內(nèi)皮細胞損傷的主要炎癥介質(zhì)。

為進一步明確膿毒癥發(fā)生內(nèi)皮細胞損傷和凋亡的分子機制，我們檢測了NF-κB途徑。NF-κB與細胞凋亡的關(guān)系密切，其參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［8］。NF-κB 的活化核轉(zhuǎn)錄是通過 IKK/NF-κB途徑進行的［9-10］。靜息狀態(tài)下，細胞質(zhì)中的p50/p65與IKB結(jié)合成三聚體，使p50/p65不能核移位。當受到菌血癥和內(nèi)毒素等刺激后，IκB發(fā)生磷酸化和降解，使NF-κB成為具有活性的形式并迅速發(fā)生核移位，在細胞核中尋找特定靶基因啟動子區(qū)的κB位點并與之結(jié)合，指導下游基因表達調(diào)控［9］。本實驗中用膿毒癥血漿刺激HUVECs，NF-κB活化，從胞漿移位入胞核，應(yīng)用NF-κB拮抗劑PDTC阻斷時，vWF降低，表明NF-κB參與了膿毒癥的內(nèi)皮細胞損傷。應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡，加入NF-κB拮抗劑PDTC后，HUVECs凋亡增加，表明NF-κB在膿毒癥血漿引起的內(nèi)皮細胞凋亡中起抑制凋亡的作用。

在膿毒癥中存在內(nèi)皮細胞損傷，內(nèi)皮細胞凋亡增加，NF-κB在膿毒癥引起的內(nèi)皮細胞損傷和凋亡中起重要作用。