慢病毒介導(dǎo)的caspase-3沉默對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

華 平， 劉家良， 楊淞然， 江慧琦， 王 萌， 陶 俊， 楊艷旗

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院心胸外科，廣東廣州510120;2廣州市第一人民醫(yī)院腦內(nèi)科，廣東廣州510180)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能，能分泌多種生物活性因子，且來源豐富，免疫原性低，是治療心肌梗死的理想種子細(xì)胞，可阻止心室重構(gòu)，改善心功能［1-2］，在心肌梗死的的細(xì)胞治療和基因治療中有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。但移植后缺血缺氧的局部微環(huán)境導(dǎo)致MSCs增殖和存活能力受限［3］，從而限制了干細(xì)胞移植的治療效果。因此，促進(jìn)細(xì)胞在非理想環(huán)境下的增殖能力，尤其是抗凋亡能力成為目前的研究熱點(diǎn)。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者［4］。本實(shí)驗(yàn)采用前期研究中篩選出來的針對(duì)caspase-3干擾效果最好的靶點(diǎn)序列構(gòu)建shRNA表達(dá)載體［5］，通過慢病毒介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染MSCs，觀察沉默caspase-3后MSCs的增殖能力、細(xì)胞周期變化和抗凋亡能力。

材料和方法

1 材料

SPF級(jí)3周齡Sprague-Dawley大鼠由中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物中心提供。胎牛血清和DMEM/F12培養(yǎng)基(HyClone)，小鼠抗大鼠CD29流式抗體(BD)，小鼠抗大鼠CD45和CD90流式抗體(eBioscience)，慢病毒載體GV115(上海吉?jiǎng)P基因)，MTS試劑盒(Promega)，細(xì)胞周期檢測試劑盒(南京凱基)，SYBR Green PCR Master Mix(Toyobo)，Trizol(Invitrogen)，兔抗大鼠 caspase-3單克隆抗體(Anbo)，Hoechst 33258(碧云天生物技術(shù)研究所)

2 方法

2．1 MSCs的培養(yǎng)與鑒定 頸椎脫臼法處死SD大鼠，75%乙醇浸濕5 min。超凈臺(tái)上取雙側(cè)股骨、脛骨，去除骨骺，注射器吸取培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔。收集沖洗液制成單細(xì)胞懸液，離心(1 500 r/min，10 min)，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以1×1010/L的密度接種，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種48 h后首次換液，以后每3 d換液，直至細(xì)胞長滿80% ～90%，0．25%胰酶消化并按1∶3傳代。經(jīng)多次換液傳代純化MSCs。流式細(xì)胞術(shù)檢測P2代CD29、CD45和CD90的表達(dá)以鑒定MSCs。

2．2 構(gòu)建慢病毒載體與細(xì)胞感染 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取針對(duì)caspase-3干擾效果最好的靶點(diǎn)序列:5'-GCCGACTTCCTGTATGCTTAC-3'，合成表達(dá) shRNA的2條互補(bǔ)DNA單鏈:5'-CCGGGCCGACTTCCTGTATGCTTACCTCGAGGTAAGCATACAGGAAGTCGGC-TTTTTG-3'，5'-AATTCAAAAAGCCGACTTCCTGTATGCTTACCTCGAGGTAAGCATACAGGAAGTCGGC-3'。上述單鏈退火形成雙鏈，連接到線性化載體GV115后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并測序。再用293T細(xì)胞包裝病毒。取良好生長狀態(tài)的MSCs以(3～5)×106/L的密度接種，細(xì)胞融合率為30%～50%時(shí)進(jìn)行病毒感染。同時(shí)制備空載體作為對(duì)照，并將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、空載體組和轉(zhuǎn)染組(由廣州萊德爾生物科技有限公司完成)。

2．3 Real-time PCR 檢測 caspase-3、bcl-2和 bax mRNA的表達(dá) 收集細(xì)胞，Trizol試劑盒抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取5μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。使用熒光定量PCR儀，采用SYBR Green染料法，以β-actin為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)條件:95℃預(yù)熱5 min，95 ℃變性15 s，60℃退火15 s，72 ℃延伸32 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列Table 1．Primer sequences

2．4 Western blotting檢測caspase-3蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，根據(jù)細(xì)胞量加入相應(yīng)的提取緩沖液，收集裂解液，BCA法測定蛋白濃度。配置5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液封閉，加入兔抗大鼠 I抗(caspase-3 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜5 min×3次，加山羊抗兔 IgG II抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次。DAB顯色。用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

2．5 MTS檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞配置成1×108/L細(xì)胞懸液接種，每孔100μL，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，收集各個(gè)時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞(24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h)加入MTS，比例為1∶10。孵育4 h后，酶標(biāo)儀讀取 A490數(shù)據(jù)。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A490值－A0)/A0×100%。A0為實(shí)驗(yàn)組第1天的A490值。

2．6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 常規(guī)消化細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗2次，加入預(yù)冷70%乙醇，4℃固定過夜。離心收集細(xì)胞，以1 mL PBS洗細(xì)胞1次，加入500μL PBS含50 mg/L溴化丙啶，100 mg/L RNase A，0．2%Triton X-100，4℃避光孵育30 min。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)數(shù)(2～3)×104個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

2．7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 用PBS溶液輕輕潤洗培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，去除PBS溶液;加入0．5 mL不含EDTA的0．25%胰酶，孵育，直至顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始從培養(yǎng)板壁脫落;輕輕連續(xù)拍打使細(xì)胞從培養(yǎng)板壁上完全脫落;將細(xì)胞輕輕重懸于預(yù)冷的緩沖液中，密度為1×109/L;轉(zhuǎn)移0．5 mL細(xì)胞懸液到干凈的離心管內(nèi);加入1．25μL Annexin V-APC，室溫避光反應(yīng) 15 min;室溫離心(1 000 r/min，5 min)，去除上清;0．5 mL預(yù)冷結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸;加入10μL溴化丙啶，冰上避光保存，流式細(xì)胞儀檢測分析。

2．8 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞以5×104/L密度接種于用12孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞爬片。加入1 mL 4%甲醛溶液，4℃固定細(xì)胞10 min。去固定液，PBS洗5 min×3次，自然晾干。滴加100μL Hoechst 33258工作液(1 mg/L)，室溫染色10 min。PBS洗5 min×3次。濾紙沾去多余液體，加抗熒光淬滅封片液，封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13．0軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

首次換液后見大量貼壁細(xì)胞，部分伸出偽足呈短棒狀。3～4 d貼壁細(xì)胞增多，細(xì)胞集落形成。9～10 d細(xì)胞融合成片，沿胞體長軸有序排列，呈旋渦狀。通過傳代逐漸純化MSCs，見圖1。免疫表型鑒定顯示表面標(biāo)志 CD29和 CD90的陽性率分別為 93．31%和93.45%，造血系統(tǒng)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45的陽性率為5．69%，見圖2，表明獲得的細(xì)胞為MSCs。

Figure 1．Morphology of MSCs(×40)．The third-generation MSCs were morphologically consistent，long spindle，arranged in a radial or spiral shape and showed colony growth under phase-contrast microscopy．圖1 MSCs的形態(tài)

Figure 2．Identification of MSCs圖2 MSCs鑒定結(jié)果

2 Real-time PCR和Western blotting檢測caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平

經(jīng)慢病毒介導(dǎo)方法導(dǎo)入質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染組、空載體組和空白對(duì)照組mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0．39±0.06、1．66 ±0．17 和1．91 ±0．31(P ＜0．01)，轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量僅為對(duì)照組的23．49%和20．31%，干擾效率為76．51%和79．69%，見圖3。通過灰度值分析，轉(zhuǎn)染組、空載體組和空白對(duì)照組的蛋白表達(dá)量分別為0．19 ±0．09、0．49 ±0．16 和 0．48 ± 0．14(P ＜0.05)，轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)量降低了61%和60%，見圖4，說明caspase-3的表達(dá)得到了很好的抑制。

Figure 3．Expression of caspase-3 mRNA．A:MSCs;B:MSCsvector;C:MSCs-shRNA．Mean ± SD．n=3．＊＊ P ＜0.01 vs A or B．圖3 Caspase-3 mRNA的表達(dá)

Figure 4．Expression of caspase-3 protein．A:MSCs;B:MSCsvector;C:MSCs-shRNA．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs A or B．圖4 Caspase-3蛋白的表達(dá)情況

3 細(xì)胞增殖

除第1天外，轉(zhuǎn)染組的增殖率在各時(shí)點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組(均P＜0．05)，而兩對(duì)照組之間無明顯差異(P＞0．05)，見圖5，證實(shí)慢病毒系統(tǒng)本身對(duì)MSCs的增殖能力無顯著影響，而沉默caspase-3能加快細(xì)胞生長。

Figure 5．Proliferative curves of MSCs-shRNA，MSCs-vector and MSCs．Mean ± SD．n=3．*P ＜ 0．05 vs MSCs or MSCs-vector．圖5 細(xì)胞增殖曲線

4 細(xì)胞周期

與空載體組和空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞百分比明顯升高(P＜0．01)，G0/G1期和G1/G2期細(xì)胞百分比下降(均P＜0．05)，對(duì)照組之前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，沉默caspase-3后MSCs主要停留在S期，見圖6和表2。

Figure 6．Cell cycle detected by flow cytometry．A:MSCs;B:MSCs-vector;C:MSCs-shRNA．圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

表2 細(xì)胞周期變化Table 2．Changes of cell cycle(%．Mean±SD．n=3)

5 Real-time PCR檢測bcl-2和bax mRNA表達(dá)水平

沉默caspase-3后，除caspase-3表達(dá)降低外，還觀察到bcl-2表達(dá)上調(diào)(P＜0．01)，bax表達(dá)下調(diào)(P＜0．01)，bcl-2/bax比值升高(P ＜0．05)，見圖7。

6 細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率顯示，轉(zhuǎn)染組的凋亡率低于對(duì)照組，見圖8。Hoechst 33258染色后在熒光顯微鏡下觀察到所有細(xì)胞的細(xì)胞核都呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，凋亡的細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核濃縮，見圖9。400倍鏡下，各組細(xì)胞選取6個(gè)不同的視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，得出轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率為(15．01 ±1．73)%，低于空載體組(25．67% ±3.05%)和空白對(duì)照組(23．67% ±1．16%)(P ＜0.05)，兩對(duì)照組之間無明顯差異(P＞0．05)。

Figure 7．Expression of bcl-2 and bax mRNA．A:MSCs;B:MSCs-vector;C:MSCs-shRNA．Mean±SD．n=3．*P＜0．05 vs A or B．圖7 bcl-2和bax mRNA的表達(dá)

Figure 8．Apoptosis of MSCs detected by flow cytometry assay．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs MSCs or MSCs-vector．圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測MSCs凋亡

Figure 9．Apoptosis of MSCs detected by Hoechst 33258 staining(×400)．A:MSCs;B:MSCs-vector;C:MSCs-shRNA圖9 Hoechst 33258染色檢測MSCs凋亡

討 論

盡管MSCs移植用于治療心肌梗死具有發(fā)展?jié)摿?，但是移植后的低存活率使得治療效果并不理想，成為其臨床應(yīng)用的瓶頸。心肌微環(huán)境是植入的MSCs賴以生存的空間位置和相互關(guān)系。微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)和生物活性分子不但對(duì)MSCs起著支持、連接、營養(yǎng)和保護(hù)等作用，還對(duì)其增殖、分化和遷移有著重要的信號(hào)調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞外基質(zhì)與MSCs黏附，通過整合素-FAK-ERK信號(hào)通路促進(jìn)MSCs生長、增殖和遷移［6］。MSCs能旁分泌多種細(xì)胞因子，尤其是堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)通過ERK的活化，具有相對(duì)較強(qiáng)的促增殖作用［7］。心肌梗死后，局部的缺血缺氧、炎癥反應(yīng)和再灌注損傷使植入的細(xì)胞面臨一個(gè)復(fù)雜、失穩(wěn)態(tài)和惡劣的微環(huán)境［8］。缺乏基質(zhì)中的存活信號(hào)，細(xì)胞毒性因子的產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞在移植后增殖能力受限，短時(shí)間內(nèi)大量凋亡［9］。同時(shí)，心肌的機(jī)械刺激也對(duì)MSCs的增殖和存活造成一定的影響。

Pouzet等［10］率先提出了“線性關(guān)系”理論，認(rèn)為增加注射細(xì)胞的數(shù)量能夠提高移植效率。但隨后的幾項(xiàng)研究結(jié)果得出了與此相悖的結(jié)論，甚至有報(bào)道稱，細(xì)胞數(shù)量的增加可導(dǎo)致左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)的惡化［11］。由于用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)的移植細(xì)胞種類各不相同，而每種細(xì)胞的生物學(xué)特性都有所差別，加上其它研究因素不盡一致，很難單純分析數(shù)量對(duì)療效的影響。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的程序性死亡，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控。Caspase家族在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。Caspase-3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，內(nèi)源性和外源性通路最后都有caspase-3的激活［12］，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。bcl-2基因家族也與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。家族成員包括促凋亡基因(bax和bag)和抗凋亡基因(bcl-xL和bcl-2)兩大類。任何因素破壞促凋亡和抗凋亡2組基因或相關(guān)蛋白之間的平衡都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)外界刺激的敏感性增加，而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。bcl-2 mRNA和bax是研究最廣泛的凋亡相關(guān)基因，兩者的比值往往決定了細(xì)胞的命運(yùn)［13］。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)caspase-3這一凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體，通過慢病毒介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)染了MSCs，在mRNA和蛋白水平對(duì)目的基因的表達(dá)起到了有效的干擾，同時(shí)觀察到bcl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)，bax mRNA表達(dá)下調(diào)，bcl-2/bax比值升高。沉默caspase-3后的MSCs增殖率明顯提高，原因可能為細(xì)胞周期受到調(diào)控，更多的細(xì)胞停留在S期和凋亡的細(xì)胞數(shù)量減少。凋亡的細(xì)胞染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞體積縮小，轉(zhuǎn)染組的凋亡率明顯低于對(duì)照組。然而，心肌梗死區(qū)域是一個(gè)以缺血缺氧為主要特點(diǎn)的復(fù)雜微環(huán)境，下一步需進(jìn)行體外缺血缺氧模擬或體內(nèi)細(xì)胞移植才能進(jìn)一步驗(yàn)證沉默caspase-3能否提高M(jìn)SCs的抗凋亡能力。