天星健骨方對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清白介素-1和腫瘤壞死因子-α的影響＊

楊曉軍，苗文麗，裴 林△，于素靜，鄭惠軍

(1.河北省中醫(yī)藥研究院，石家莊 050031;2.唐山市第四醫(yī)院，河北唐山 063000;3.唐山市衛(wèi)生監(jiān)督所，河北唐山 063000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病，是臨床常見多發(fā)病，發(fā)病機(jī)理尚未完全明確，亦缺乏根治及預(yù)防本病的措施。近年來發(fā)現(xiàn)，免疫調(diào)節(jié)功能紊亂在RA的發(fā)病、病理改變中起主導(dǎo)作用，其中細(xì)胞因子的大量釋放在介導(dǎo)AR炎癥組織損傷中起關(guān)鍵作用［1］。本室從事風(fēng)濕免疫性疾病研究多年，有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，采用天星健骨方在控制活動期RA中發(fā)揮其獨(dú)特的功效。本研究以細(xì)胞因子為切入點(diǎn)，通過天星健骨方對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1、TNF-a影響的研究，以探討中醫(yī)藥起效的主要作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD清潔級雌性大鼠60只，體質(zhì)量120±10 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證編號DK0411-0005)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食，12 h光亮/黑暗條件、23～26℃環(huán)境溫度，單籠喂養(yǎng)。

1.2 藥物

天星健骨方由雷公藤、制南星、土茯苓、青風(fēng)藤、薏苡仁、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂等組成，中藥飲片由河北省中醫(yī)藥研究院飲片廠提供，由河北省中醫(yī)藥研究院制劑室制成濃縮膠囊。雷公藤多甙片為湖南株州制藥廠產(chǎn)品(批號ZJ0010)。

1.3 試劑與儀器

弗氏完全佐劑(FCA)由Sigma公司提供;足趾容積測量儀YLS-TA購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站;大鼠IL-1、TNF-a試劑盒(上海朗卡生物技術(shù)有限公司);3550酶標(biāo)儀(美國伯樂)。

2 方法

2.1 造模建立與分組

60只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成正常組10只，免疫造模組50只。對每只動物進(jìn)行標(biāo)記，用足容積測量儀準(zhǔn)確測量，并記錄大鼠左側(cè)足爪容積(以下排水毫升數(shù)計)。造模方法［2］為將大鼠固定，在每只大鼠左足跖皮下注射弗氏完全佐劑(FCA)0.lml，正常對照組以同樣方法同時注射等量生理鹽水。然后每天觀察藥物反應(yīng)，并測量局部腫脹情況。至造模第12天，將RA模型大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥低量組、中藥中量組、中藥高量組、雷公藤多甙組，每組10只。

2.2 給藥方法

于造模第12天開始，正常組、模型組灌服10 ml/kg生理鹽水;中藥低量組灌服0.4 g/kg、中藥中量組灌服0.6 g/kg、中藥中高量組灌服0.8 g/kg天星健骨方混懸液;雷公藤多甙組灌服2 mg/kg雷公藤多甙混懸液，每天1次，持續(xù)至28 d。常規(guī)喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

在致炎前和致炎后分別測定大鼠左側(cè)足爪容積，求出腫脹度(致炎后足爪容積一致炎前足爪容積)，以觀察藥物對AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響;雙抗體夾心ELISA法檢測IL-1、TNF-a，按試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SAS 6.12軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 大鼠左后足爪容積的比較

表1顯示，模型組50只大鼠左后足爪于致炎后第1天均開始出現(xiàn)明顯腫脹，然后逐漸加重，第20天達(dá)到高峰，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。中藥高量組從致炎后16 d開始發(fā)揮療效，在致炎后20 d中藥中高量組足腫脹度與模型組比較均有下降(P＜0.01，P＜0.05)，且中藥高量組作用優(yōu)于雷公藤多甙組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠足爪腫脹度比較(±s，n=10)

表1 各組大鼠足爪腫脹度比較(±s，n=10)

注:與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊P＜0.01;與雷公藤多甙組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP ＜0.01

組別腫脹度(ml)12 d 16 d 20 d 24 d 28 d正 常 組 0.270±0.032＊＊ 0.288±0.054＊＊ 0.315±0.017＊＊ 0.309±0.075＊＊ 0.310 ±0.022＊＊模 型 組 0.478±0.067 0.465±0.033 0.505±0.024 0.479±0.052 0.468±0.071中 藥 低 量 組 0.462±0.026 0.445±0.047 0.448±0.037＊＊ 0.434±0.054* 0.417±0.018*中 藥 中 量 組 0.485±0.016 0.457±0.034 0.424±0.038＊＊ 0.376±0.026＊＊ 0.382±0.051＊＊中 藥 高 量 組 0.455±0.048 0.433±0.045 0.402±0.019＊＊Δ 0.343±0.042＊＊ΔΔ 0.325±0.027＊＊Δ雷 公 藤 多 甙 組 0.465±0.078 0.462±0.049 0.440±0.038＊＊ 0.392±0.010＊＊ 0.364±0.037＊＊

3.2 各組大鼠血清IL-1、TNF-a含量的比較

表2顯示，各組與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明各組血清IL-1和TNF-a顯著增高。中藥高量組指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明藥物治療在減少細(xì)胞因子的分泌上有一定的作用。

表2 各組大鼠血清IL-1、TNF-a含量比較(pg/ml，±s)

表2 各組大鼠血清IL-1、TNF-a含量比較(pg/ml，±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05;與正常組比較:ΔP＜0.01

組別 鼠數(shù)IL-1 TNF-a正 常 組 10 91.24±15.32Δ 54.88±24.27Δ模 型 組 10 175.35±56.17 184.35±51.46中藥低量組 10 169.82±63.62 165.42±50.12中藥中量組 10 142.14±77.23 157.32±11.25中藥高量組 10 125.28±42.48* 132.33±58.19*雷公藤多甙組 10 133.32±44.10 139.09±42.89*

4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，免疫調(diào)節(jié)功能紊亂在RA的發(fā)病、病理改變中起主導(dǎo)作用，其中T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能失調(diào)有重要意義［3］。由于抑制性T細(xì)胞減少、活性降低，使TH/TS平衡失調(diào)，導(dǎo)致體液免疫過亢產(chǎn)生大量自身抗體，以及細(xì)胞因子的大量釋放從而介導(dǎo)了AR炎癥組織損傷［4］。細(xì)胞因子(cyotkine，CK)是由免疫細(xì)胞(如單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等)和某些非免疫細(xì)胞(如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)經(jīng)刺激而合成、分泌的一類生物活性物質(zhì)，在AR的發(fā)病中具有促炎、抑炎或刺激、抑制的正負(fù)反饋的免疫調(diào)控作用［5］。外周血中淋巴細(xì)胞中IL-1、TNF-a在RA發(fā)生中“中心”致炎細(xì)胞因子是AR發(fā)病的重要炎癥介質(zhì)［6，7］。IL-1和TNF-a在活動性RA中主要參與以下病理過程［8］:①通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞匯集到關(guān)節(jié)腔;②可刺激結(jié)締組織細(xì)胞和多形核細(xì)胞產(chǎn)生小分子炎性遞質(zhì)，如前列腺素等;③通過刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞破壞骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨和軟骨的破壞。

目前，臨床上治療主要針對癥狀的改善和延緩、控制病情進(jìn)展，所用藥物主要包括:非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、腎上腺皮質(zhì)激素、生物制劑等。但病因至今未明，尚缺乏針對性治療;或因現(xiàn)有的治療藥物毒副作用大，或因價格昂貴，患者不易接受或難以堅(jiān)持長期服用。因此，從中醫(yī)學(xué)的角度探討其病因病機(jī)，尋求有效的治療方法，對RA的控制有著重要的臨床意義。RA屬于中醫(yī)痹病范疇，在長期的臨床實(shí)踐中，采用天星健骨方對本病的治療積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。有研究表明，雷公藤多苷(tripterygium glycosides，TG)具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎止痛等作用［9，10］，本實(shí)驗(yàn)室采用其作為對照，研究天星健骨方組方上的優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模12 d后，模型組與正常對照組足腫脹度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其各組大鼠血清IL-1、TNF-a含量顯著增高(P＜0.01)，表明佐劑誘導(dǎo)了大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。經(jīng)治療后中藥高量組從致炎后16 d開始發(fā)揮療效，在致炎后20 d中藥中高量組足腫脹度與模型組比較均有下降(P＜0.01，P＜0.05)，且中藥高量組作用優(yōu)于雷公藤多甙組(P＜0.05)。與此同時，治療組均能降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1和TNF-a水平，中藥高量組指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明對大鼠關(guān)節(jié)炎具有一定抑制作用，可通過降低大鼠血清中的IL-1、TNF-a含量，抑制滑膜細(xì)胞的增生，緩解炎性細(xì)胞的浸潤，從而減輕關(guān)節(jié)滑膜的炎癥。顯示其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有治療作用，在緩解RA關(guān)節(jié)炎癥方面療效確切，且在療效上較單味藥雷公藤多苷有一定的優(yōu)勢。由于條件限制，本文只選擇RA部分活動性細(xì)胞因子指標(biāo)，但未能進(jìn)行這些指標(biāo)的相關(guān)性分析研究，這還有待于今后進(jìn)一步的研究。

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