荔枝核總皂苷提取工藝優(yōu)化

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(南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

荔枝核總皂苷提取工藝優(yōu)化

邢學(xué)鋒，譚偉華，王愛珍，王志威

(南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

目的：探討荔枝核總皂苷的最佳提取工藝參數(shù)。方法：通過對溶媒和提取方式的篩選，確定最佳溶媒和提取方式，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化各項(xiàng)工藝參數(shù)。結(jié)果：采用乙醇回流提取，其最佳參數(shù)為A2B3C3D2即10倍量50%乙醇回流提取3次，每次2 h，可測定含量為5.51%。以D-101大孔吸附樹脂純化提取液，100 mL 50%乙醇洗脫得率為99.69%，純度為36.24%。結(jié)論：此乙醇回流提取法可行，為實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)和進(jìn)一步藥用研究提供理論參考。

荔枝核；皂苷類；提取法；溶媒

荔枝(LitchichinensisSonn.)是無患子科Aspindaceae荔枝屬植物[1]。近年來學(xué)者對荔枝核的化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行了不少研究。荔枝核的主要化學(xué)成分為皂苷、揮發(fā)油、有機(jī)酸、酯、氨基酸、糖類及微量元素等[2],成分之一皂苷具有降血糖[3]、調(diào)血脂[4]等多種藥理活性。本研究擬以荔枝核為對象，對荔枝核總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為其深加工產(chǎn)品工藝提供理論參考，促進(jìn)荔枝從單純的食用水果，轉(zhuǎn)化成高附加值產(chǎn)品和中藥制劑。

1 材料與儀器

荔枝核中藥飲片(廣州至信中藥飲片有限公司，生產(chǎn)批號:120201，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)藥用植物與鑒定教研室馬驥教授鑒定)，人參皂苷Rg1對照品703-9206(中國藥品生物制品檢定所)，D-101大孔吸附樹脂，電子天平P602S-DA，電子微量天平CP324S，紫外可見分光光度計(jì)HP-8453，所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與提取溶媒、方式的篩選

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 用電子微量天平精密稱取5 mg對照品人參皂苷Rg1，配制成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，分別取20、40、80、160、200、240 μL標(biāo)準(zhǔn)液于小試管中,水浴揮干，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴加熱15 min,冰水冷卻5 min，加入3 mL冰醋酸，搖勻靜置10 min，在540 nm波長下測定吸光度。并以標(biāo)樣濃度c(μg/μL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=30.67C+0.005(r=0.997 9)，線性范圍為10～120 μg。通過精密度、重現(xiàn)性和回收率實(shí)驗(yàn),人參皂苷Rg1檢測濃度在0～0.025 μg/μL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.2 提取溶媒和方式的篩選 稱取荔枝核飲片50.00 g 3分,標(biāo)記1)、2)、3)作不同處理。1)用水500 mL浸泡1 h，回流提取一次1 h；2)用70%乙醇浸泡1 h，回流提取一次1 h;3)用70%乙醇500 mL浸泡1 h，超聲提取一次1 h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味,記錄濃縮后的體積。取各提取液25 mL，以蒸餾水定容至100 mL，各取40 μL稀釋液，按“2.1.1”項(xiàng)操作測定吸光度。結(jié)果顯示醇提測定的總皂苷含量為2.82%，高于水提的1.81%和超聲提取的1.28%。

2.2 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化 根據(jù)提取溶媒和提取方式篩選的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，荔枝核總皂苷選用乙醇回流提取，并采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)。

2.2.1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn) 采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),選用影響提取效果的乙醇用量/倍(A)、提取次數(shù)/次(B)、提取時(shí)間/h(C)和乙醇濃度/%(D)4個(gè)試驗(yàn)因素,每個(gè)因素設(shè)置3水平進(jìn)行優(yōu)選設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 乙醇回流提取的4因素3水平

2.2.2 直觀分析 每次實(shí)驗(yàn)稱取荔枝核飲片50.00 g,按每個(gè)實(shí)驗(yàn)號的條件加入乙醇浸泡1 h，回流提取，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，得到9個(gè)提取液樣品，記錄各自濃縮后的體積。按“2.1.2”項(xiàng)操作測定吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各樣品總皂苷含量。使用正交設(shè)計(jì)小助手分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到直觀分析表，見表2。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)RSDlt;5%。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表

2.2.3 方差分析 見表3。比較F比大小，發(fā)現(xiàn)荔枝核總皂苷提取工藝影響因素的順序?yàn)?提取時(shí)間gt;提取次數(shù)gt;乙醇濃度gt;乙醇用量,其中提取次數(shù)(B)、提取時(shí)間(C)在α=0.05的檢驗(yàn)水平下有差異。根據(jù)L9(34)正交效應(yīng)曲線，得最佳條件為A2B3C3D2，即10倍量50%乙醇回流提取3次，每次2 h。

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方差分析

注：F0.05,2,2=19.00，F(xiàn)0.01,2,2=99.00。

2.2.4 提取工藝參數(shù)的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)得到的最佳提取工藝參數(shù)提取新樣品，并按“2.1.2”項(xiàng)操作，測得其吸光度均值為0.353 32，總皂苷含量5.51%，RSD為0.93%，重現(xiàn)性良好。

2.3 荔枝核總皂苷部位純化

2.3.1 洗脫溶劑和溶劑量的選擇 D-101型大孔吸附樹脂預(yù)處理與裝柱后，取“2.2.4”濃縮液20 mL上柱,依次用0%(蒸餾水)、30%、50%、70%、90%乙醇100 mL洗脫。取各洗脫液100 μL，按“2.1.1”項(xiàng)操作測定吸光度。洗脫前收集液在540 nm波長不見峰值，提示提取濃縮液上柱后沒有過載，且50%乙醇能將荔枝核中大部分總皂苷洗脫。另取濃縮液20 mL上柱，依次以蒸餾水、50%乙醇200 mL洗脫，每洗脫50 mL收集洗脫液2滴,并按“2.1.1”項(xiàng)操作測定其吸光度峰值。結(jié)果顯示，用50%乙醇100 mL可將20 mL樣品濃縮液中大部分總皂苷洗脫。

2.3.2 最優(yōu)條件荔枝核提取液洗脫率 取“2.2.4”提取的最佳參數(shù)樣品2分，1分取25 mL以蒸餾水定容至100 mL，另一分取20 mL直接上柱，并用50%乙醇100 mL洗脫,收集洗脫液。取稀釋液和收集的洗脫液各40 μL,按“2.1.1”項(xiàng)操作測定吸光度。計(jì)算得總皂苷含量分別為5.51%和5.49%，洗脫率為99.69%。RSDlt;5%。

2.3.3 洗脫液中總皂苷純度 取一干燥潔凈蒸發(fā)皿稱重m1，“2.2.4”提取的最佳參數(shù)樣品20 mL上柱，用50%乙醇100 mL洗脫，用蒸發(fā)皿收集洗脫液100 mL。干燥后稱重m2，得洗脫液中總皂苷純度為36.24%。

3 結(jié)果

荔枝核總皂苷提取工藝采用乙醇回流提取，影響因素順序?yàn)椋禾崛r(shí)間gt;提取次數(shù)gt;乙醇濃度gt;乙醇用量，最佳條件A2B3C3D2，即10倍量50%乙醇回流提取3次，每次2 h，可測定含量為5.51%。以D-101大孔吸附樹脂純化提取液，100 mL50%乙醇洗脫得率為99.69%，純度為36.24%。

4 討論

皂苷類成分是荔枝核活性作用的有效部位之一。根據(jù)對照品穩(wěn)定性、參比物質(zhì)與測定物質(zhì)同質(zhì)性的原則[5]，在本研究的前期階段已選用人參皂苷Rg1作為對照品，通過精密度、重現(xiàn)性和回收率實(shí)驗(yàn)，建立荔枝核總皂苷的含量測定方法[6],用于提取工藝優(yōu)選的定量分析。方歡樂等[7]采用兩相溶劑萃取法處理樣品,但未計(jì)算其純度。因荔枝核皂苷的苷元部分多為疏水性，能被非極性樹脂所吸附。D-101大孔吸附樹脂是一種球狀、非極性聚合物吸附劑，對皂苷類物質(zhì)有特殊的選擇性。 本研究得出的荔枝核總皂苷提取工藝，僅在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，主要以比色法測定計(jì)算的總皂苷含量為考察指標(biāo)，為實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)和進(jìn)一步藥用研究提供理論參考，并未考慮操作環(huán)節(jié)、材料成本、提取周期、能耗等生產(chǎn)要素。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:227.

[2]劉朝霞,錢敏,陳海光.荔枝核的加工研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,38(3):87-89.

[3]姜振國,任坤,林?,等.荔枝核降血糖有效部位的研究(一)[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,27(1):14-16.

[4]朱曉瑩,銀彩林.荔枝核復(fù)方對糖尿病小鼠血糖、血脂影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2012,19(15):5-6.

[5]國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心.藥品技術(shù)評價(jià)文集(第3輯)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2009:161-165.

[6]解生旭,徐暾海,韓冬,等.紫外可見分光光度法測定蒺藜果中呋甾總皂苷含量[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,24(5):495-496.

[7]方歡樂,陳衍斌.荔枝核皂苷含量測定及提取工藝優(yōu)選研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2010,6(3):17-19.

R283.3

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1007-4813(2013)03-0537-02

邢學(xué)鋒(1981-),男，講師。研究方向：中藥新藥研發(fā)及中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)。

2013-01-20)