益氣消法中藥含藥血清對人臍靜脈內(nèi)皮細胞株細胞增殖、遷移及凋亡的影響

劉麗麗，李 爽，李海東，宋卓敏

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系，天津 300070；3.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

1 材料與方法

1.2 含藥血清制備 選SD大鼠，體質(zhì)量（375±25）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。實驗前，置動物于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，常規(guī)喂養(yǎng)1周。將體質(zhì)量≥400g或者≤350g的SD大鼠予以剔除。共體質(zhì)量相近的SD大鼠50只，按隨機數(shù)字表法分為4組：正常對照組、中藥高、中、低劑量組，每組10只。正常對照組：給予蒸餾水。中藥高、中、低劑量組：用藥劑量為根據(jù)人的日用藥量，按大鼠體表面積比率換算成等效劑量的2、1、0.5倍，具體數(shù)據(jù)分別為4、2、1g/kg干粉（相當于18、9、4.5g/kg生藥）。每次1mL/100g體質(zhì)量，每天2次，間隔10h，連續(xù)灌胃5d，第5天上午灌服藥物后1h腹主動脈取血，離心處理后，取血清2mL左右，置于無菌試管中，56℃水浴滅活30min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，密封，-20℃冰箱中凍存。

1.3 實驗試劑和儀器 17β-雌二醇（美國Sigma公司）；ICI-182780（美國Sigma公司）。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（EA.hy926）購自中國科學院上海細胞庫，體外培養(yǎng)傳代；DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO）；優(yōu)質(zhì)小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；MTT粉（北京天港邦定生物醫(yī)學科技有限公司）；二甲基亞砜（上海菲達有限公司）；青、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；流式細胞儀（FCM，Becton-dickinson公司）。

1.4 研究方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（EA.hy926），接種于含10％小牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)，至EA.hy926細胞生長成單層后備用。

1.4.2 細胞分組及干預(yù) 培養(yǎng)的EA.hy926細胞，隨機分為6組：正常對照血清組；17 β-Estradiol組（簡稱E2組）；E2加ICI 182，780組（簡稱E2加ICI組）；E2加中藥高劑量含藥血清組；E2加中藥中劑量含藥血清組；E2加中藥低劑量含藥血清組。用DMEM培養(yǎng)液配成終濃度為15％的含藥血清或?qū)φ昭澹珽2終濃度10-8mol/L，ICI終濃度10-7mol/L。

1.4.3 MTT法檢測EA.hy926細胞增殖 將對數(shù)生長期的EA.hy926細胞，胰酶消化后細胞計數(shù)，以5×105個/L濃度接種于96孔培養(yǎng)板，200μL每孔，常規(guī)培養(yǎng)過夜，使細胞貼附，孵育24h后，棄原培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液，180μL每孔。根據(jù)實驗分組設(shè)計將不同濃度的含藥血清及試劑以每孔20μL量加入。繼續(xù)孵育48h后，每孔加入MTT 20μL，繼續(xù)孵育4h。傾去藥液及培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150μL，振蕩10min，37℃繼續(xù)孵育，直至鏡下觀察二甲基亞砜全部溶解后，以自動酶標儀，490nm波長測定吸光度值（A值），每組6個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次，取其平均值。

1.4.4 劃痕法檢查EA.hy926的遷移能力 將對數(shù)生長期的EA.hy926細胞，胰酶消化后細胞計數(shù)，以5×105個/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板。常規(guī)培養(yǎng)過夜，使細胞貼附，孵育24h后，棄去培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基漂洗1次，此時用無菌的槍頭（tips）沿各孔中軸均勻劃一道裸露的無細胞帶，用PBS漂洗劃下的細胞2～3次。根據(jù)實驗分組設(shè)計加入無血清的DMEM培養(yǎng)液配制的不同濃度的含藥血清及試劑，每組均設(shè)6個平行孔，以這一時間點作為零時間點，后置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別在0、48h兩個時間點，在倒置顯微鏡下觀察同一位置的細胞遷移情況，拍照記錄。每孔隨即選擇測3個視野，取平均值計算細胞遷移數(shù)。重復(fù)實驗3次。

1.4.5 流式細胞術(shù)檢測EA.hy926細胞凋亡率 將對數(shù)生長期的EA.hy926細胞，胰酶消化后細胞計數(shù)，以5×105個/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)過夜，使細胞貼附，孵育24h后，棄原培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液。根據(jù)實驗分組設(shè)計加入不同濃度的含藥血清及試劑。繼續(xù)孵育48h后，胰酶消化（無EDTA），迅速加入收集的培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)。1 500r/min離心5min，棄上清，收集細胞于10mL離心管中。4℃預(yù)冷的PBS洗2次。用PBS結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為106細胞/mL。取200μL細胞懸液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V-FITC（150mg/L）和5μL碘化丙錠（PI，120mg/L），混勻后室溫避光孵育15min，在反應(yīng)管中加500μL PBS，流式細胞儀分析。重復(fù)實驗3次。

1.4.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較應(yīng)用One-way ANOVA進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

表1 各組EA.hy926細胞增殖、遷移數(shù)、細胞凋亡的比較（±s，n=18）

表1 各組EA.hy926細胞增殖、遷移數(shù)、細胞凋亡的比較（±s，n=18）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與E2組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與E2加中藥高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 細胞增殖 細胞遷移數(shù)/個 細胞凋亡率/％正常對照血清組 0.433±0.044△△▲ 170.39±10.56△△▲▲ 8.021±0.641△△▲▲E2組 0.602±0.027##▲▲ 214.56±14.78##▲▲ 5.418±0.873##▲▲E2加ICI組 0.447±0.017△△▲▲ 174.39±10.98△△▲▲ 7.643±1.020△△▲E2加中藥高劑量含藥血清組 0.478±0.015△## 187.94±9.43##△△ 6.514±0.580##△△E2加中藥中劑量含藥血清組 0.521±0.022##△△▲▲ 199.39±14.59##△△▲ 5.333±0.950##▲▲E2加中藥低劑量含藥血清組 0.587±0.223##▲▲ 209.33±26.51##▲▲ 5.457±0.676##▲▲

如表1所示：正常組EA.hy926細胞的增殖低于E2組、E2加中藥中、低劑量組（P＜0.01）、E2加中藥高劑量組（P＜0.05），與E2加ICI組相比無顯著性差異（P＞0.05）；E2組高于除E2加中藥低劑量組外的其它各組（P＜0.01），與E2加中藥低劑量組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；E2加中藥高劑量組EA.hy926細胞的增殖顯著低于E2加中藥中、低劑量組（P＜0.01），高于E2加ICI組（P＜0.01），E2加中藥中劑量組顯著低于E2加中藥低劑量組（P＜0.01）。

正常組EA.hy926細胞遷移數(shù)顯著低于E2組、E2加中藥高、中、低劑量組（P＜0.01），與E2加ICI組相比無顯著性差異（P＞0.05）；E2組高于除E2加中藥低劑量組外的其它各組（P＜0.01），與E2加中藥低劑量組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；E2加中藥高劑量組低于E2加中藥中劑量組（P＜0.05）及E2加中藥低劑量組（P＜0.01），顯著高于E2加ICI組（P＜0.01），E2加中藥中劑量組低于E2加中藥低劑量組（P＜0.05）。

正常組EA.hy926細胞凋亡率顯著高于E2組、E2加中藥高、中、低劑量組（P＜0.01），與E2加ICI組相比無顯著性差異（P＞0.05），E2組顯著低于除E2加中藥中、低劑量組外的其它各組（P＜0.01），與E2加中藥中、低劑量組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；E2加中藥高劑量組EA.hy926細胞凋亡率顯著高于E2加中藥中、低劑量組（P＜0.01），低于E2加ICI組（P＜0.05）；E2加中藥中劑量組與E2加中藥低劑量組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)E2處理的EA.hy926細胞，其增值、遷移明顯高于正常組，細胞凋亡率明顯低于正常組；而ICI和益氣消法中藥均可明顯阻斷E2對EA.hy926的細胞的增值、遷移的促進作用，阻斷E2對EA.hy926細胞的凋亡的抑制作用，與E2組比較有顯著差異（P＜0.01）。據(jù)現(xiàn)代藥理研究該方中多味中藥有抗腫瘤血管生成作用。黨參提取物對紫杉醇抑制血管生成和移植腫瘤轉(zhuǎn)移有一定的增強作用［2］。莪術(shù)油注射液對小鼠移植性S180肉瘤血管形成有抑制作用［3］。續(xù)斷有抑制子宮收縮、調(diào)節(jié)機體免疫、改善局部血循環(huán)、促進血腫的吸收機化、抗感染等藥理作用［4］。鱉甲有調(diào)節(jié)機體免疫、抗腫瘤、抗突變、抗纖維化等藥理作用［5］。白芥子有抗腫瘤、抗雄激素、抑菌等藥理作用［6］。郁金及其提取物有保護染色體突變的作用，對癌細胞有明顯的抑制作用［7］。此為益氣消法中藥干擾血管生成過程，抑制血管新生，從而抑制子宮肌瘤血管生長、肌瘤發(fā)展的原因之一。但其具體機制尚需進一步探討。

［1］哈孝賢，董素芹，劉永志，等.肌瘤丸治療子宮肌瘤的臨床研究：附384例病例報告［J］.天津中醫(yī)，1996，13（2）：1-3.

［2］柏長青，宋穎芳，王德堂，等.黃芪、黨參提取物增強紫杉醇抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移的實驗研究［J］.細胞與分子免疫學雜志，2008，24（4）：375-377.

［3］馮剛，黃濤，盧宏達，等.莪術(shù)油注射液對小鼠移植性S180肉瘤血管形成的抑制作用［J］.腫瘤研究與臨床，2005，17（4）：233.

［4］晏媛，鄭萍.續(xù)斷的藥理學研究進展［J］.中醫(yī)藥研究，2002，18（5）：53-54.

［5］溫欣，周洪雷.鱉甲化學成分和藥理藥效研究進展［J］.西北藥學雜志，2008，23（2）：122-124.

［6］歐敏銳，吳國欣，林躍鑫.中藥白芥子研究概述［J］.海峽藥學，2001，13（2）：8-11.

［7］何必立，呂賓，徐毅，等.郁金對胃癌細胞的抑制作用及其對血管內(nèi)皮生長因子表達的影響［J］.中醫(yī)藥學刊，2006，24（9）：1741-1743.