免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測IgA腎病患者尿足細(xì)胞的效果比較

姜文玲，彭佑銘，劉 虹，夏運成，劉伏友

(中南大學(xué)湘雅第二醫(yī)院腎臟病研究所腎病實驗室，湖南 長沙 410011)

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測IgA腎病患者尿足細(xì)胞的效果比較

姜文玲，彭佑銘，劉 虹，夏運成，劉伏友

(中南大學(xué)湘雅第二醫(yī)院腎臟病研究所腎病實驗室，湖南 長沙 410011)

目的: 比較免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色2種方法檢測IgA腎病(IgAN)患者尿足細(xì)胞的效果，為尿足細(xì)胞檢測方法的選擇提供依據(jù)。方法：收集43 例確診為IgAN患者(實驗組)和10例正常對照研究對象(對照組)活檢前連續(xù)3 d的晨尿各200 mL，離心上清制成涂片。IgAN患者按Lee分級分成LeeⅠ～LeeⅤ組。采用抗人足細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白Podocalyxin(PCX)單克隆抗體對尿沉渣涂片分別行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色，熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡下計數(shù)2組研究對象尿足細(xì)胞數(shù)；采用Spearman相關(guān)分析法分析2種方法檢測IgAN患者尿足細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果：2種方法檢測的對照組研究對象尿中未見足細(xì)胞，2種方法檢測實驗組研究對象尿中均可見足細(xì)胞；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測足細(xì)胞陽性率和檢出中位數(shù)低于免疫酶細(xì)胞化學(xué)法，2種方法檢測尿足細(xì)胞陽性率和中位數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)；2種方法檢查患者尿足細(xì)胞數(shù)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.842，Plt;0.01)。結(jié)論：采用免疫酶細(xì)胞化學(xué)法檢測同一份尿標(biāo)本的效果優(yōu)于免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法。

免疫酶細(xì)胞化學(xué)； 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)； 足細(xì)胞； 尿液

IgA腎病(IgA nephropathy,IgAN)是最常見的原發(fā)性腎小球疾病,15%～ 40% 的成人患者在10 年后會進(jìn)展至終末期腎病(end stage renal disease,ESRD),若隨訪時間超過25 年,該比例可達(dá)30%～ 50%[1]。足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，是腎小球中最易受到損傷的細(xì)胞成分[2]，是組成腎小球濾過膜的主要成分和阻止大分子濾過的最后屏障，其在維持毛細(xì)血管攀的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、調(diào)節(jié)腎小球的濾過功能和腎小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)的代謝平衡中發(fā)揮重要作用[3]。隨著近年來對足細(xì)胞生物學(xué)研究的深入,尤其是在發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞中表達(dá)的一些特異性蛋白分子之后,足細(xì)胞已被認(rèn)為是各種原發(fā)或繼發(fā)性腎小球疾病進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞[4]。足細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白Podocalyxin (PCX) 是足細(xì)胞表面覆蓋的一層唾液酸糖蛋白，位于足細(xì)胞膜上，由于PCX在許多腎小球疾病中不依賴于裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)的完整性而保存完好，因此也是識別尿足細(xì)胞最常用的標(biāo)記蛋白[5]，PCX帶有大量負(fù)電荷，是防止足突間粘連，維持裂孔膜結(jié)構(gòu)和腎小球濾過膜電荷屏障最主要的物質(zhì)基礎(chǔ)。已有研究[6]發(fā)現(xiàn)：表達(dá)其他幾種標(biāo)志蛋白的足細(xì)胞幾乎都表達(dá)PCX，即使是凋亡的足細(xì)胞仍然表達(dá)PCX。因此，臨床上將尿PCX 作為檢測各種腎小球疾病患者尿足細(xì)胞的標(biāo)志分子，Yamaguchi等[7]認(rèn)為：應(yīng)用抗PCX單克隆抗體對尿沉渣進(jìn)行免疫熒光染色，是一種檢測尿中足細(xì)胞的特異性方法。為了更準(zhǔn)確地反映尿足細(xì)胞脫落的情況，本課題組連續(xù)收集患者活檢前3 d晨尿標(biāo)本，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色和免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色法2種不同方法，計數(shù) IgAN不同分級研究對象中的尿足細(xì)胞數(shù)(未治療)，并對2種方法的檢出陽性率及其相關(guān)性進(jìn)行對比分析，為尿足細(xì)胞研究方法的選擇提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1 研究對象 選擇2008年9月—2009年2月在本院腎內(nèi)科住院的43例經(jīng)腎活檢確診為IgAN患者作為實驗組，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[8]，繼發(fā)性IgAN患者均被剔除，Lee’s分級采用1982年Lee等[9]關(guān)于IgAN組織學(xué)分級方法，將IgA患者分為LeeⅠ～LeeⅤ組?；顧z前3 d收集實驗組患者的尿標(biāo)本，活檢腎組織進(jìn)行石蠟包埋。其中男性14例，女性29例，年齡14～64歲，平均年齡(31.9±12.5)歲。另外選擇本院腎病內(nèi)科在職工作人員10例，均無高血壓、糖尿病、心和腎疾病史，當(dāng)年常規(guī)體檢均正常者作為對照組，收集對照組研究對象的尿標(biāo)本。所有受試者均知情同意。

1.2 尿標(biāo)本的收集 分3 d收集患者活檢前晨尿各200 mL，各取100 mL于低速離心機1 500 r·min-1離心5 min，棄去上清液，留存1 mL沉渣尿，混勻，取20 μL沉渣尿于光學(xué)顯微鏡下用牛鮑氏計算板記數(shù)單個核細(xì)胞數(shù)。單個核細(xì)胞陽性標(biāo)本繼續(xù)離心涂片。

1.3 尿沉渣涂片和計數(shù) 所有玻片均經(jīng)多聚賴氨酸處理。用微量加樣器吸取并混勻后，吸取尿沉渣溶液300 μL于TXD3細(xì)胞離心涂片機上，1 500 r·min-1離心5 min，涂片，每個患者每天制成4張涂片，其中2張用于免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，另2張則用于免疫酶細(xì)胞化學(xué)法染色。連續(xù)測3 d,共制成12張涂片，取6張涂片計數(shù)足細(xì)胞數(shù)的平均值記為該患者的尿足細(xì)胞數(shù)。

1.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色 將上述待染標(biāo)本的涂片以PBS清洗3次后,置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100中5 min,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的牛血清白蛋白(BSA)封閉,室溫15 min,小鼠抗人PCX單克隆抗體(美國Ramp;D公司)1∶10稀釋,4 ℃過夜,FITC熒光標(biāo)記兔抗小鼠IgG(丹麥DAKO公司)體積比為1∶20稀釋,4 ℃孵育4 h,甘油封片,熒光顯微鏡(日本OLYMPUSBX251) 的綠色熒光波長為520 nm。尿液細(xì)胞形態(tài)完整,PCX染色胞漿陽性。每次實驗均設(shè)PBS代替一抗的陰性對照組。

1.5 免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色 涂片采用3%H2O2封閉20 min，10%脫脂奶粉封閉，室溫20 min，滴加第一抗體(鼠抗人PCX抗體，1∶10稀釋)，4℃孵育過夜；免疫組織化學(xué)Elivision TM-plus試劑盒(鼠/兔)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。除脫脂奶粉不需用PBS洗滌，所有步驟均需PBS洗滌。

1.6 足細(xì)胞計數(shù)方法 低倍鏡下觀察全片，高倍鏡下確認(rèn)足細(xì)胞并攝像，計算機儲存，然后在全片左、右、上、下和中間5個不同視野，記數(shù)20個高倍視野所見足細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。足細(xì)胞數(shù)以M(P25，P75)表示，同一個患者尿標(biāo)本2種方法所測足細(xì)胞數(shù)比較采用配對t檢驗；2種方法檢測的足細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 2種方法測得的尿足細(xì)胞數(shù) 2種方法在對照組研究對象尿中均未測得足細(xì)胞。2種方法在實驗組研究對象尿中均可見足細(xì)胞且免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色法檢測的尿足細(xì)胞陽性率(81%)和尿足細(xì)胞中位數(shù)值[8(0.00，31.00)]均高于免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測的尿足細(xì)胞陽性率(62%)和尿足細(xì)胞中位數(shù)值[2(0.00，20.00)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。見表1。

表1 免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色法和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測對照組和實驗組研究對象的尿足細(xì)胞數(shù)

Tab.1 Number of urinary podocytes of objects in control group and experiment group by immunoenzymatic celluar chemistry and immunofluorescence celluar chemistry method

*Plt;0.05vscontrol group;△Plt;0.05vsimmunofluorescence celluar chemistry method.

2.2 2種方法檢測不同分級IgAN患者尿足細(xì)胞數(shù) LeeⅠ～LeeⅤ各分級研究對象的尿足細(xì)胞中位數(shù)值分別如下：LeeⅠ組,0(0.00，4.00)， 0(0.50，4.00)；LeeⅡ組,1(0.00，3.00)， 3(0.00，8.00)；LeeⅢ組,3(0.00，15.00)， 10(0.00，30.00)；LeeⅣ組,6.5(0.00，20.00)， 12(0.00，31.00)；LeeⅤ組,16(13.00，23.00)， 23(12.00，32.00)；可見在不同Lee分級IgAN患者組中免疫酶化學(xué)法測得的足細(xì)胞中位數(shù)值比免疫熒光法測得的足細(xì)胞中位數(shù)值高。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，足細(xì)胞胞漿為明亮的翠綠色，細(xì)胞核位置呈黑色；免疫酶細(xì)胞組織化學(xué)染色，足細(xì)胞胞漿染色顯棕色沉積為陽性，胞核圓形，染成藍(lán)色，見圖1(插頁六)。

2.3 2種方法檢測IgAN患者尿足細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析 2種方法檢測的尿足細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.842，Plt;0.01)。見圖2。

3 討 論

IgAN是以腎小球系膜區(qū)大量IgA 或以IgA 為主的免疫球蛋白沉積為主要特點的臨床最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，是導(dǎo)致ESED的主要原因之一。其臨床表現(xiàn)多樣，腎臟病理活檢形態(tài)不一，預(yù)后也相差懸殊。據(jù)統(tǒng)計，IgAN約占我國原發(fā)性腎小球疾病的30% ～ 40%，而且每10 年約有20%的患者會進(jìn)展到慢性腎衰竭[10]。經(jīng)皮腎穿刺活檢是確診腎臟疾病的最可靠方法，也是診斷腎病的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。但腎活檢是一項有創(chuàng)的檢查方法，因受客觀條件的限制，部分患者不能進(jìn)行腎臟活檢，而且腎活檢也難以用于動態(tài)追蹤觀察，這無疑給腎臟疾病的早期診斷和病情追蹤帶來困難。尿蛋白是臨床通常使用的觀測指標(biāo)，研究[12]證實：足細(xì)胞位于腎小球毛細(xì)血管壁最外層,以其次級突起即足突和基底膜相連,足突間有裂隙隔,其上覆蓋的裂隙隔膜是構(gòu)成腎小球血液濾過屏障的主要成分。足細(xì)胞受損后從腎小球基底膜脫落,導(dǎo)致濾過膜的完整性被破壞,是蛋白尿發(fā)生的病理基礎(chǔ)之一,因此尿足細(xì)胞的情況能預(yù)測蛋白尿的發(fā)生和程度[13-14]，檢測尿足細(xì)胞是新近發(fā)展起來的一項無創(chuàng)檢查,該無創(chuàng)性檢測方法在評估腎臟病理的類型、指導(dǎo)臨床治療和判斷愈后的臨床應(yīng)用價值倍受關(guān)注。沈沛成等[15]認(rèn)為：尿足細(xì)胞陽性的IgAN患者系膜基質(zhì)增多、間質(zhì)纖維化和足突融合的程度明顯重于尿足細(xì)胞陰性患者,而系膜細(xì)胞增生、新月體、基底膜增厚、血管襻壞死、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和小管萎縮的程度兩者間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。前組指標(biāo)(包含系膜基質(zhì)、間質(zhì)纖維化和足突融合)反映的是病變的慢性化程度,而后組指標(biāo)(包含系膜細(xì)胞增生、新月體、基底膜增厚、血管襻壞死、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和小管萎縮)多為急性活動性病變,經(jīng)積極治療后可逆轉(zhuǎn)。由此可見,尿足細(xì)胞陽性的IgAN患者的病程多呈進(jìn)展性,動態(tài)觀察尿足細(xì)胞數(shù)的變化對判斷病情的發(fā)展和疾病的預(yù)后有一定的幫助。本文作者[16]曾經(jīng)用免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色法就IgAN患者腎臟病理Lee氏分級各組研究對象尿足細(xì)胞的排泄特征和腎組織PCX表達(dá)進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)IgAN患者腎臟病理Lee氏分級各組研究對象尿足細(xì)胞數(shù)組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，IgAN患者Lee氏Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分級組尿足細(xì)胞中位數(shù)和陽性率分別高于Lee氏Ⅰ和Ⅱ分級組研究對象尿足細(xì)胞中位數(shù)和陽性率，證明IgAN患者有尿足細(xì)胞的損傷，且尿脫落足細(xì)胞對IgAN患者病程有一定預(yù)測性，尿足細(xì)胞檢測可作為IgAN的一項臨床無創(chuàng)檢查的指標(biāo)。雖然尿足細(xì)胞檢測在臨床實踐中的應(yīng)用還有很多問題需要進(jìn)一步研究和探索，但是已有的眾多研究支持尿足細(xì)胞成為一種有用的非侵襲性的腎小球疾病活動性的標(biāo)記，因此，今后需要更大規(guī)模的臨床前瞻性研究證實尿足細(xì)胞在腎小球疾病診斷中的有效性，故尿足細(xì)胞檢測的方法尤為重要，這直接關(guān)系到檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。本研究針對IgAN患者，連續(xù)3 d收集患者治療和診斷前的晨尿標(biāo)本，每個患者均做平行對照，且每個患者涂片均用2種方法記數(shù)足細(xì)胞，目的就是為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究結(jié)果表明：2種方法均能很好地檢測出IgAN患者尿中的足細(xì)胞，2種方法平行檢測IgAN各Lee氏分級研究對象結(jié)果一致，2種方法具有良好的相關(guān)性，雖然免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法簡單易行且其結(jié)果鏡下易辨認(rèn)，但其陽性率和中位數(shù)值可能受尿液成分的影響，尤其是一些破碎細(xì)胞、鹽類結(jié)晶和黏液絲等易與尿中足細(xì)胞黏連或被掩埋導(dǎo)致熒光著色顯著減弱[17]，或由于尿沉渣中充滿的紅細(xì)胞或管型在細(xì)胞離心涂片后也被固定和染色，其存在能導(dǎo)致較強的熒光信號，影響足細(xì)胞計數(shù)[18]，而免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色檢測的尿足細(xì)胞陽性率和尿足細(xì)胞中位數(shù)值均高于免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測的尿足細(xì)胞陽性率和尿足細(xì)胞中位數(shù)值，且不需要熒光顯微鏡，方便基層開展，受其他成分干擾小，且由于免疫酶細(xì)胞染色方法本身有第二步放大效應(yīng)，結(jié)果好辨認(rèn)，也適用于保存和反復(fù)計數(shù)，故本文作者認(rèn)為免疫酶細(xì)胞染色是檢測尿足細(xì)胞數(shù)較好的一種方法，值得推廣應(yīng)用。

圖2 2種方法檢測尿足細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性

Fig.2 Correlation between urinary podocyte count of IgAN patients detected by two kinds of method

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Comparisonofeffectbetweenimmunoenzymaticcelluarchemistryandimmunofluorescencecelluarchemistryindetectingurinarypodocytes

JIANG Wen-ling,PENG You-ming,LIU Hong,XIA Yun-cheng,LIU Fu-you

(Department of Nephrology,Institute of Nephrology,Second Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410011,China)

ObjectiveTo compare the effects of immunofluorescence and immunoenzymatic celluar chemistry in detecting the urinary podocytes of IgA nephropathy (IgAN) patients and to provide basis for selecting the detection method of urinary podocytes.Methods200 mL morning urine samples were collected from 43 cases who diagnosed as IgAN (experiment group) and 10 cases of normal control subjects (control group) for 3 consecutives days before renal biopsy,and the smears were made from the supernatant by centrifugation.The IgAN patients were classified into Lee Ⅰ -Lee Ⅴ groups according to Lee degree method.Immunofluorescence and immunoenzymatic celluar chemistry with monoclonal anti-podocalyxin(PCX) antibody were performed to detect the urinary podocytes and the number of urinary podocytes was counted by fluorescence and optical microscope;the correlation between the number of urinary podocytes detected by two kinds of methods were analyzed by Spearman correlation analysis.ResultsThere were no urinary podocytes of the objects in control group detected by two kinds of methods,but in experiment group they were visible;the positive rate and the median of urinary podocytes detected by immunofluorescence celluar chemistry were lower than those detected by immunoenzymatic celluar chemistry (Plt;0.05);there was a positive correlation between two kinds of methods(r=0.842，Plt;0.01).ConclusionImmunoenzymatic celluar chemistry is more effective compared with immunofluorescence celluar chemistry in detecting the urinary podocytes.

immunoenzymatic celluar chemistry;immunofluorescence celluar chemistry;podocyte;urine

1671-587Ⅹ(2013)06-1242-05

10.7694/jldxyxb20130633

2013-05-06

國家自然科學(xué)基金資助課題(81170663)

姜文玲(1972-)，女，山東省煙臺市人，主管技師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事腎臟病臨床檢驗和病理研究。

彭佑銘(Tel：0731-85293584， E-mail:pengym5577@yahoo.com.cn)

R544.14

A