超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水體與底泥中孔雀石綠及隱色孔雀石綠殘留

孫言春，李池陶，杜寧寧，曹頂臣，牟振波*，吳 松，王海濤，陳中祥

(1.中國水產(chǎn)科學研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(哈爾濱)，黑龍江 哈爾濱 150070;2.哈爾濱工業(yè)大學 理學院，黑龍江 哈爾濱 150001)

孔雀石綠(Malachite green，MG)又名堿性綠、苯胺綠，曾作為一種工業(yè)染料廣泛用作羊毛、絲綢、皮革等的染色劑［1］。由于MG還具有殺滅真菌、寄生蟲等病原微生物的作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用來預防和治療受精卵和成魚的水霉病、腮霉病和小瓜蟲病等，以及用于活魚運輸、池塘暫養(yǎng)過程和環(huán)境的消毒等［2－5］。然而，MG在生物體內(nèi)有明顯蓄積現(xiàn)象且具有高毒、高殘留、致癌、致畸、致突變等毒副作用，對生物體的組織、生殖、免疫系統(tǒng)均有影響，尤其是其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠(Leucomalachite green，LMG)毒性更大［6－12］。因此，包括歐美、中國在內(nèi)的國家都明令禁止其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［13］，以確保消費者健康和水產(chǎn)貿(mào)易的對外地位。

雖然MG在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的違禁使用情況越來越少，但由于其曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用，已對環(huán)境造成了嚴重污染，尤其是表層沉積物作為MG在環(huán)境中的最終歸宿，且不斷向水體進行緩慢釋放，成為其二次污染的主要來源［5，14－15］。因此，評估表層沉積物和水體中的MG及其代謝物殘留狀況，建立相應(yīng)的分析方法，對于水產(chǎn)品中MG污染來源的排查具有積極的意義。

目前，針對水體、底泥等環(huán)境中的痕量MG及其代謝物的檢測方法相對較少，且主要采用靈敏度較低的液相色譜法［16－19］。由于底泥等沉積物的成份復雜，各種雜質(zhì)多，對分析干擾大，高效液相色譜對樣品的凈化要求較高，整個操作步驟繁瑣、耗時長，不利于準確定性和定量分析。而高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法由于靈敏度高、專屬性強，因此在MG藥物殘留檢測上獲得了廣泛的應(yīng)用［20－23］。已有研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定了水或底泥中MG和隱色LMG殘留［24－26］，但其前處理方法較繁瑣，不適合大批量樣品的檢測需要。

本研究充分利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜靈敏度高、專屬性強的優(yōu)點，對水體及表層沉積物中的MG及其代謝物進行提取、濃縮，優(yōu)化了前處理過程，能夠快速準確檢測出養(yǎng)殖水體及沉積物中殘存的痕量MG及其代謝物，可為污染來源排查及評價生態(tài)環(huán)境對健康養(yǎng)殖的影響提供可靠的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

AcquityTM超高效液相色譜儀，Micromass Quattro micro API三重四極桿質(zhì)譜(配電噴霧離子源)，MassLynxTMV 4.1操作軟件(Waters公司);XS205電子天平(Mettler Toledo公司);GX271自動固相萃取儀(Gilson公司);Biofuge Stratos高速冷凍離心機(Thermo Scientific公司);T25 digital Ultra－Turrax均質(zhì)機，MS1 Mini－shaker渦輪振蕩器(IKA公司);Milli-Q A10純水器(Millipore公司);移液器(200、1 000、5 000 μL，Eppendorf公司);PHS－3C pH計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

MG、LMG、MG-D5、LMG-D6(純度≥99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司);甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司);二氯甲烷(色譜純，美國Fluka公司);實驗用水由Millipore A10純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備;乙酸銨(LC/MS級)、乙酸(色譜純)、甲酸(純度＞98%)均購自美國Fluka公司;N，N，N'，N'-四甲基對苯二胺(TMPD，生物試劑)，濃鹽酸(分析純);固相提取小柱Agilent Accu-BOND SCX(美國Agilent公司，200 mg/3 mL)，Oasis MCX(美國Waters公司，150 mg/6 mL)，Oasis WCX(美國Waters公司，150 mg/6 mL)。

TMPD溶液(1.0 g/L):稱取50 mg TMPD溶于50 mL甲醇中;檸檬酸緩沖溶液(pH 2.6):10.5 g檸檬酸鹽溶入500 mL水中，配成0.1 mol/L檸檬酸鹽溶液;將14.2 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)溶于500 mL水中，配成0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液，將445.5 mL 0.1 mol/L檸檬酸鹽溶液和54.5 mL 0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液混合即可;標準溶液:準確稱取MG和LMG標準品及對應(yīng)內(nèi)標，用甲醇溶解并稀釋成100 mg/L的儲備液，室溫下可穩(wěn)定3個月;儲備液用80%乙腈溶液(乙腈∶5 mmol/L的乙酸銨溶液=8∶2，體積比)作稀釋液配成1.0 mg/L的中間工作溶液，然后用該稀釋液將中間液配制成相應(yīng)濃度的標準工作溶液;內(nèi)標溶液使用前用稀釋液配成兩種物質(zhì)濃度均為0.1 mg/L的混合溶液。

1.3 采樣方法

水樣采集:用廣口瓶取500 mL水樣，加入40 mL TMPD溶液，4 000 r/min離心5 min，超聲3 min，過0.45 μm尼龍濾膜。加入100 μg/L MG及LMG內(nèi)標混合液50 μL，放置10 min，然后加入檸檬酸緩沖溶液(pH 2.6)和甲醇各30 mL。超聲10 min后，進行固相萃取。

底泥樣品采集:取表層沉積物樣品，用均質(zhì)機充分均質(zhì)后，稱取5.0 g，加入200 μL TMPD溶液和50 μL 100 μg/L的MG及LMG內(nèi)標混合液，放置10 min，備用。

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm，50 mm×2.1 mm);柱溫:35℃;樣品室溫度:10℃;流動相A:含0.1%甲酸的5 mmol/L的乙酸銨水溶液;流動相B:0.1%甲酸乙腈溶液;進樣體積:10 μL;流速:0.30 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min，40%B;1.0～3.0 min，40%～95%B;3.0～5.0 min，95%～40%B。

1.5 質(zhì)譜條件

電離方式:ESI(+);電離電壓:2.5 kV;錐孔電壓:45 V;離子源溫度:110℃;錐孔反吹氣流量:50 L/h;脫溶劑氣溫度:380℃;脫溶劑氣流量:550 L/h;采集方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);定性、定量離子對見表1。

表1 目標化合物的MRM監(jiān)測離子對及其質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric conditions for monitoring of target compounds

1.6 前處理方法

水樣:預先用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL檸檬酸緩沖溶液(pH 2.6)活化Waters Oasis MCX(150 mg，6 mL)SPE柱，然后將“1.3”制備的水樣過柱。依次用3 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液、5 mL水、5 mL 50%甲醇水溶液、3 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液。真空抽干后，用5 mL乙酸乙酯－甲醇－氨水(50∶45∶5)混合溶液進行洗脫，收集于10 mL離心管中，于45℃下氮氣吹干。殘留物加入1.0 mL的乙腈－5 mmol/L乙酸銨溶液(80∶20)，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機相濾膜后，上機檢測。

底泥樣品:準確稱取(5.0±0.05)g底泥樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入15 mL乙腈，旋渦2 min，超聲萃取20 min后靜置30 min;再向離心管中加入10 mL二氯甲烷，旋渦2 min后，4 000 r/min離心5 min，取下層清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶;再次向離心管中加入10 mL乙腈－二氯甲烷混合液(3∶2)，重復上述操作，合并萃取液，于45℃旋轉(zhuǎn)蒸干;殘余物加入1.0 mL的乙腈－5 mmol/L乙酸銨溶液(80∶20)，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機相濾膜后，上機檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

MG及其代謝物LMG屬于三苯基甲烷類化合物，具有弱堿性，因此可以通過調(diào)節(jié)流動相的pH值來抑制弱堿的解離，同時加入甲酸和乙酸銨有利于目標分析物的分子離子化，并改善峰形。采用梯度洗脫有利于將目標分析物和基質(zhì)分開，并有利于提高離子化效果。在已有文獻的研究基礎(chǔ)上［17－18，21］，通過優(yōu)化得到的液相洗脫條件如“1.4”所示。根據(jù)MG和LMG的化學性質(zhì)，選擇ESI正離子模式。用流動注射進樣方式對MG、LMG及其對應(yīng)內(nèi)標物質(zhì)的母離子進行掃描，得到其準分子離子峰，再以適當?shù)呐鲎材芰繉史肿与x子進行子離子掃描，響應(yīng)值最強的子離子作為定量離子，響應(yīng)值相對較強的離子作為定性離子。以MRM掃描模式對母離子與子離子進行碎裂電壓及碰撞能量的優(yōu)化，優(yōu)化后的參數(shù)見表1。采用優(yōu)化后的色譜條件和質(zhì)譜條件，MG和LMG及其對應(yīng)內(nèi)標的標準溶液質(zhì)量色譜圖如圖1所示。

圖1 MG、LMG及其對應(yīng)內(nèi)標標準品溶液(2.0 μg/L)的 MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of MG，LMG ，MG-D5，LMG-D6at 2.0 μg/L standard solution

2.2 水溶液萃取固相萃取柱的選擇

水體中MG和LMG含量一般較低，因此需對樣品進行提取、富集和凈化?，F(xiàn)有方法中，生物基質(zhì)多采用氧化鋁柱凈化，但水體極性較大，氧化鋁對目標化合物有一定的吸附造成目標化合物回收率偏低。因此，本文比較了Oasis MCX、Oasis WCX和AccuBOND SCX 3種陽離子交換固相萃取柱對水體中MG和LMG的凈化效果，發(fā)現(xiàn)MCX柱對這2種化合物的保留效果較好(見表2)。WCX柱對 MG保留較差，回收率低，對LMG保留較好;而SCX柱的效果則相反。這可能是因為Oasis MCX柱具有反相與陽離子交換雙重機理，其選擇性更強，效果更好，因此本研究選用Oasis MCX柱進行樣品凈化處理?？紤]到水環(huán)境中MG及其代謝物的濃度一般較小，按照最大吸附量是填料的二十分之一來計算，選擇150 mg/6 mL規(guī)格的固相萃取柱已滿足分析方法的要求。

表2 WCX、MCX和SCX固相萃取柱對回收率的影響Table 2 Influence of WCX，MCX and SCX SPE on recoveries of MG and LMG

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

陽離子交換柱適合堿性化合物的富集和凈化，因此一般采用酸性溶液活化，堿性溶液洗脫。本實驗在甲醇和水活化的基礎(chǔ)上，選用pH 2.6的檸檬酸緩沖溶液繼續(xù)活化，可保持填料對陽離子和非極性分子的吸附活性，同時使目標分析物保持正離子態(tài)而被吸附保留在柱上，從而提高填料對目標分析物的吸附活性。由于需要堿性有機溶液才能使填料失活解吸，因此可以選擇用酸性或中性溶液淋洗萃取柱，洗去極性大和極性較小的共存有機干擾物質(zhì)，最后用堿性溶液洗脫。本實驗按照極性逐漸減小的順序，依次用0.1 mol/L的鹽酸溶液、水、50%甲醇水溶液、3 mL正己烷淋洗，以去除吸附在填料上的大部分基質(zhì)干擾。同時考察了甲醇－氨水(95∶5)、乙腈－氨水(95∶5)、乙酸乙酯－甲醇－氨水(50∶45∶5)3種洗脫液的洗脫效果。結(jié)果表明，在同等體積下，乙酸乙酯－甲醇－氨水(50∶45∶5)的洗脫效果最好，回收率最高，因此選擇其為洗脫溶液。將500 mL 5.0 μg/L的水溶液按照“1.6”方法過柱后，持續(xù)加入12 mL洗脫液，分別用過濾管收集流出液，每2 mL收集1管。45℃下氮氣吹干后，殘余物加入1.0 mL乙腈－5 mmol/L的乙酸銨溶液(80∶20)，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機相濾膜后，上機檢測。發(fā)現(xiàn)8 mL以后的洗脫液中，均檢測不到目標分析物，說明8 mL洗脫液可將目標物完全洗脫。為保證洗脫完全，在實際應(yīng)用時采用10 mL洗脫液進行洗脫。濃縮富集前加入MG-D5和LMG-D6內(nèi)標，結(jié)果顯示方法的回收率、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好。

2.4 底泥樣品中濃縮富集條件的優(yōu)化

底泥樣品均質(zhì)稱量后，需加入一定量的TMPD溶液作為抗氧化劑來提高樣品中MG和LMG的回收率。對固體樣品中MG和LMG的提取，常用的提取溶劑包括乙腈、甲醇、乙酸銨緩沖液和二氯甲烷等［18－23］。常用的方法是先加入乙腈，使底泥中的目標分析物溶解到乙腈溶液中，然后用二氯甲烷將乙腈中的MG和LMG反萃取到二氯甲烷溶液中，最后將二氯甲烷提取液進一步濃縮和凈化。本實驗考察了乙腈和二氯甲烷的體積比分別為2∶3、1∶1和3∶2時的提取效果，回收率結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，乙腈與二氯甲烷采用3∶2比例時，回收率最高，穩(wěn)定性較好，因此選擇乙腈和二氯甲烷體積比為3∶2的混合液為提取液。以有機試劑對固體粉碎樣品進行提取時，一般采用有機試劑的體積為固體樣品質(zhì)量的5倍左右，以使提取液和樣品表面充分接觸而提高提取效果，因此選擇加入25 mL提取液，即先加入15 mL乙腈，渦旋和超聲提取后，再加入10 mL二氯甲烷渦旋和離心。再次向離心管中加入10 mL乙腈－二氯甲烷混合液提取液，重復提取一次，合并萃取液，于45℃旋轉(zhuǎn)蒸干，可使回收率達到80%以上。

表3 不同乙腈和二氯甲烷體積比對回收率的影響Table 3 Influence of different volume ratio of HCN to DCM on recoveries of MG and LMG

2.5 方法的標準曲線與靈敏度

在優(yōu)化條件下，分別采用內(nèi)標法和外標法考察了MG和LMG的線性范圍(見表4)，結(jié)果顯示兩者質(zhì)量濃度均在0.2～100 μg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r2大于0.995。但采用外標法對實際樣品進行定量時，MG和LMG在環(huán)境水和底泥樣品中的回收率分別在45%和60%左右，這可能是基質(zhì)效應(yīng)造成的結(jié)果。而采用內(nèi)標法定量時，回收率分別在80%和90%左右，大大減少了基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，因此本方法采用內(nèi)標法定量。

表4 MG和LMG的回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r2)Table 4 Regression equation and correlation coefficients(r2)of MG and LMG

采用向陰性樣品中添加標準物質(zhì)的方法，進一步考察方法的靈敏度。在方法規(guī)定的取樣體積和定容體積下，按3倍信噪比計算得該方法在環(huán)境水樣和底泥樣品中的檢出限(LOD)分別為0.2 ng/L和0.02 μg/kg，以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)分別為0.4 ng/L和0.04 μg/kg。

2.6 方法的回收率與精密度

采用空白加標的方式，在環(huán)境水樣中分別添加1.0、10.0、100 ng/L 3個濃度梯度，底泥中MG和LMG分別添加0.20、2.00、20.0 μg/kg，按照本方法處理后測定，回收率和相對標準偏差見表5。

表5 養(yǎng)殖環(huán)境水和底泥中MG和LMG的加標回收率及相對標準偏差Table 5 Spiked recoveries and RSDs of MG and LMG in negative water and sediment in aquatic environment

由表5可見，在養(yǎng)殖環(huán)境水體中，MG和LMG的平均回收率為77%～90%，RSD為7.2%～11.4%;底泥中MG和LMG的平均回收率為82%～91%，RSD為6.3%～11.6%。因此，MG和LMG在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境水和底泥中的加標回收率均能達到檢測要求，說明本方法具有較高的準確性。同時，RSD均低于15%，表明結(jié)果在置信區(qū)間內(nèi)，本方法具有較高的可靠性。

2.7 實際樣品的測定

采用該方法測定了東北地區(qū)11家水產(chǎn)養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖池塘水體和底泥中MG和LMG的殘留情況，在3家檢出的養(yǎng)殖場中，其水體中MG的濃度為2.7～11.6 ng/L，LMG的濃度為6.5～21.6 ng/L;底泥中MG的濃度為0.8～18.7 μg/kg，LMG的濃度為2.8～26.4 μg/kg。經(jīng)進一步調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該3家養(yǎng)殖場在幾年前確曾采用過MG來防治和治療水霉病，因此，該方法可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境水體和底泥中MG和LMG殘留量的測定。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化固相萃取條件和液液萃取條件，建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境水體和底泥中MG和LMG殘留的高靈敏分析和確證方法。結(jié)果表明，本方法在0.2～100 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，水體和底泥中的檢出限分別為0.2 ng/L和0.02 μg/kg;相對標準偏差(RSD)均小于12%。該方法步驟簡單、回收率高、精密度良好?？勺鳛樗w和底泥中MG及其代謝物LMG殘留的檢測方法，并可為MG及LMG在水產(chǎn)品中的富集規(guī)律及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段，為水產(chǎn)品中MG及LMG溯源和衛(wèi)生監(jiān)督提供檢測技術(shù)支持。

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