山奈素與牛血清蛋白相互作用:Tachiya模型與Stern－Volmer方程的對(duì)比研究

陶慧林，黎舒懷，徐銘澤，周素蓮，劉帥濤，易忠勝

(桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541004)

隨著光譜技術(shù)的不斷發(fā)展，以靈敏度高、信號(hào)穩(wěn)定為特征的熒光光譜法已成為研究藥物及其他小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的重要手段［1－3］。山奈素(Kaempferide，KF)化學(xué)名為4-甲氧基-3，5，7-三羥基黃酮(見(jiàn)圖1)，是一種廣泛分布在高等植物中的黃酮類化合物，具有祛痰、防治咳嗽和哮喘、降低血壓、降血脂、抗動(dòng)脈硬化等多種生物功能［4］。在腫瘤臨床治療的應(yīng)用上，KF與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用可起到協(xié)同增效的抗腫瘤作用，可望成為有效的抗癌防癌的治療及保健制劑［5］。目前對(duì)于KF與牛血清蛋白(BSA)相互作用的研究主要集中在單純的熒光光譜法和紫外可見(jiàn)吸收光譜法［6－7］，得到的信息有限，不能滿足進(jìn)一步研究的需要。

本實(shí)驗(yàn)利用熒光光譜和紫外可見(jiàn)吸收光譜法，首次采用Tachiya模型與Stern－Volmer方程比較研究了生理?xiàng)l件下KF與BSA之間的相互作用，對(duì)二者相互作用的模式、作用力類型以及熱力學(xué)性質(zhì)等方面作出闡釋。為闡明藥物與白蛋白的作用機(jī)制，了解藥物在生命體內(nèi)的存儲(chǔ)和運(yùn)輸情況，進(jìn)一步研究天然黃酮類化合物在生物體內(nèi)的作用提供了重要信息。

圖1 山奈素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of kaempferide

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光光度計(jì)(日本島津);Carry-50型紫外－可見(jiàn)吸收光譜分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安);EL204電子分析天平;PT-10便攜式pH計(jì)。

山奈素(生化試劑，99.0%):用無(wú)水乙醇配制成3.494×10－3mol/L儲(chǔ)備溶液，使用時(shí)移取適量?jī)?chǔ)備溶液，用二次水稀釋至1.0×10－4mol·L－1;牛血清白蛋白(BSA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司):用 pH 7.4 的 Tris－HCl緩沖溶液(含 0.10 mol·L－1NaCl以維持離子強(qiáng)度)配制 1.0 ×10－5mol·L－1的BSA儲(chǔ)備溶液，于4℃以下保存?zhèn)溆?。其它試劑均為分析純，?shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL比色管中準(zhǔn)確移入1.00 mL 1.0×10－5mol·L－1BSA溶液，用微量注射器依次加入不同量的KF溶液，用pH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液定容至10 mL。在設(shè)定溫度(298、304、310 K)下于恒溫水浴中靜置5 min。設(shè)定激發(fā)光柵和發(fā)射光柵的狹縫寬度為3.0 nm/5.0 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，恒溫掃描BSA在290～500 nm的熒光發(fā)射光譜。分別固定Δλ=15 nm及Δλ=60 nm，記錄KF與BSA混合溶液的同步熒光光譜。測(cè)定物質(zhì)的量濃度比為1∶1的KF與BSA溶液的紫外吸收光譜及熒光發(fā)射光譜。

圖2 298 K時(shí)KF對(duì)BSA的熒光猝滅圖Fig.2 Fluorescence quenching spectra of BSA in the presence of KF at 298 K

2 結(jié)果與討論

2.1 應(yīng)用Stern－Volmer方程研究KF與BSA相互作用

2.1.1 KF對(duì)BSA的熒光猝滅光譜 將BSA的濃度固定，逐漸增大KF溶液的濃度，熒光猝滅圖如圖2所示。BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基使其具有內(nèi)源性熒光，在348 nm處有最大熒光峰。隨著KF濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度明顯降低，這表明KF和BSA之間發(fā)生了結(jié)合作用。此外，BSA的最大發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)藍(lán)移，表明隨著KF濃度的增大BSA發(fā)色團(tuán)的疏水環(huán)境發(fā)生了改變。

2.1.2 KF對(duì)BSA熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)的確定

通過(guò)Stern－Volmer方程［8］分析熒光猝滅數(shù)據(jù):

式中:Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為無(wú)猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命，生物大分子的熒光壽命約為10－8s，F(xiàn)0和F分別為未加入和加入KF時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度，［Q］為猝滅劑KF的濃度。KF和BSA之間相互作用的Stern－Volmer猝滅常數(shù)KSV及相關(guān)系數(shù)r計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溫度下KF與BSA相互作用的Stern－Volmer猝滅常數(shù)Table 1 Stern－Volmer constant of interaction between KF and BSA at different temperatures

圖3 不同溫度下KF對(duì)BSA熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線Fig.3 The double logarithmic curves for the quenching of BSA fluorescence by KF at different temperatures

對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)約為 2 ×1010L·mol－1·s－1［9］。此外，動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅可根據(jù)猝滅常數(shù)KSV隨溫度的變化關(guān)系加以判斷。對(duì)于靜態(tài)猝滅，KSV值隨著溫度升高而降低，而對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，溫度的升高將增加有效碰撞和加劇電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，使熒光猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大［10］。結(jié)果表明該反應(yīng)的 Kq值大于2.0×1010L·mol－1·s－1，且 KSV的值隨著溫度升高而降低，表明猝滅是靜態(tài)猝滅，反應(yīng)形成了BSA－KF基態(tài)復(fù)合體。

2.1.3 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)，其結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可從下式獲得［11］:

式中n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，Ka為表觀結(jié)合常數(shù)，由上式作lg(F0/F－1)～lg［Q］圖(見(jiàn)圖3)。圖中直線的斜率即結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，截距即lgKa，依直線的斜率和截距即可求出KF與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n(見(jiàn)表2)。結(jié)果表明，KF和BSA之間存在強(qiáng)大的結(jié)合力，并且結(jié)合常數(shù)Ka隨著溫度升高而增大，這表明升高溫度后KF與BSA的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致BSA－KF復(fù)合體的穩(wěn)定性增大。n值接近于1，表明KF與BSA具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

表2 通過(guò)Stern－Volmer方程得到的KF與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Table 2 Binding parameters obtained from the interaction of KF with BSA by Stern－Volmer equation

2.1.4 熒光給體－受體間距離的求取 根據(jù)F rster偶極－偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論［12］，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移時(shí)，非輻射能量轉(zhuǎn)移效率E、供能體與受體之間的結(jié)合距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間有下列關(guān)系:

式中K2=2/3;R0是E=50%時(shí)的臨界距離;N為介質(zhì)折射常數(shù)，取水和有機(jī)物折射指數(shù)的平均值1.336;Φ為血清白蛋白的熒光量子產(chǎn)率，通常取蛋白質(zhì)中色氨酸的量子產(chǎn)率0.15［13］;J為給體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分。圖4為298 K(A)、304 K(B)、310 K(C)溫度下，BSA的熒光光譜與KF的紫外吸收光譜的重疊圖譜。

圖4 BSA熒光光譜與KF吸收光譜的重疊圖Fig.4 Overlap spectra of BSA's fluorescence emission spectra(1)and kaempferide's UV absorption spectra(2)temperature(A－C):298，304，310 K;cBSA=cKF=1.0×10－5mol·L－1

由式(3)～(6)分別求得不同溫度下的能量轉(zhuǎn)移效率E、KF在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)以及蛋白質(zhì)分子中的214位色氨酸殘基的距離r，結(jié)果如表3所示。由結(jié)果可知，KF在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)與蛋白質(zhì)分子中的色氨酸殘基Trp 214的距離r＜7 nm，具備了能量轉(zhuǎn)移猝滅蛋白質(zhì)熒光的條件，因此非輻射能量轉(zhuǎn)移也是引起熒光猝滅的原因之一。另外，在溫度為298、304 K時(shí)，由于結(jié)合距離r小于能量轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離R0，說(shuō)明非輻射能量轉(zhuǎn)移引起蛋白質(zhì)熒光峰猝滅的幾率比靜態(tài)猝滅大，因此非輻射能量轉(zhuǎn)移是KF引起B(yǎng)SA熒光猝滅的主要原因。隨著溫度升高，能量轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離R0與結(jié)合距離r均逐漸增大，并在310 K時(shí)，能量轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離R0約等于藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合距離，因此推測(cè)人體生理溫度下，非輻射能量轉(zhuǎn)移與靜態(tài)猝滅共同導(dǎo)致了BSA的熒光猝滅。

表3 BSA熒光光譜與KF吸收光譜重疊積分J與結(jié)合距離rTable 3 The overlap integral and binding distances between fluorescence spectra of BSA and absorption spectra of KF

2.2 利用Tachiya模型研究山奈素與蛋白質(zhì)相互作用

2.2.1 Tachiya模型［14－15］分子與蛋白質(zhì)之間的吸附與解吸可用下式表示:

式中，Qaq表示猝滅劑分子，Bn表示帶n個(gè)猝滅劑的BSA。如果BSA中結(jié)合位點(diǎn)為m，假設(shè)式(7)中的速率常數(shù)是合理的:

式中，nav是生物分子中結(jié)合的猝滅劑的平均數(shù)目，可以通過(guò)下式計(jì)算得到nav:

在式(12)和式(13)中消去［Qaq］，可以得到:

從BSA到猝滅劑的F rster能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)為:

τ0為沒(méi)有猝滅劑存在時(shí)BSA的熒光壽命，r是BSA與猝滅劑之間的距離，R0是F rster非輻射能量轉(zhuǎn)移距離。如果生物分子在與BSA有相同距離r處有n個(gè)結(jié)合的猝滅位點(diǎn)，熒光強(qiáng)度會(huì)變?yōu)?

在有無(wú)猝滅劑存在的情況下，二者猝滅強(qiáng)度的比值為:

nav可由式(14)求出。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以獲知［M］、［Q］和F/F0的值，結(jié)合式(17)和(14)，可以計(jì)算出未知變量m、K和r的值，它們均由方程(17)所擬合出的F/F0～［Q］＆［M］曲線所決定。對(duì)固定的［M］值，F(xiàn)/F0會(huì)隨［Q］值增大而減小。然而［Q］值足夠大時(shí)，F(xiàn)/F0會(huì)飽和。因?yàn)楫?dāng)所有BSA的結(jié)合位點(diǎn)都被猝滅劑占去后，繼續(xù)增大［Q］不再使結(jié)合的猝滅劑數(shù)目增加。飽和時(shí)猝滅劑結(jié)合的數(shù)目如下:

因此飽和時(shí)的熒光強(qiáng)可以表示為:

另外，［Q］足夠小時(shí)生物的平均猝滅結(jié)合數(shù)目也很小，可結(jié)合式(14)計(jì)算得到:

情況 3.2 {1,2,3}不是X中頂點(diǎn)色集合,以下僅考慮31≤n≤34時(shí)的情況,此時(shí)C中至多有3個(gè)集合不是X和Y中頂點(diǎn)色集合。

此種情況下猝滅結(jié)合數(shù)目的分布約等于:

從而得出熒光強(qiáng)度為:

此處nav可由式(20)得到。

2.2.2 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合距離的求取 通過(guò)式(22)可知，當(dāng)［Q］足夠低時(shí)，F(xiàn)/F0與［Q］成比例，且比例系數(shù)由K、r和［M］決定。因此K、r的值可以由測(cè)量?jī)蓚€(gè)不同［M］值時(shí)的F/F0～［Q］曲線來(lái)確定。不同溫度下的F/F0～［Q］曲線如圖5所示。

圖5 不同溫度時(shí)的F/F0～KF濃度關(guān)系圖Fig.5 Curves of F/F0versus concentration of KF obtained by the Tachiya model at different temperatures A.298 K，B.304 K，C.310 K;cBSA: .10 μmol·L －1， .5 μmol·L －1

由式(22)可得BSA與KF相互作用的結(jié)合常數(shù)K如表4所示，結(jié)合常數(shù)K隨溫度的增加而增大，這種趨勢(shì)與Stern－Volme方程得到的結(jié)果一致。但由Stern－Volme方程得到的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)幾乎不隨溫度變化而變化，而由Tachiya模型得到的實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)數(shù)卻隨溫度的變化而變化很大。這主要是由于Tachiya模型將結(jié)合位點(diǎn)數(shù)m與分子實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n進(jìn)行了區(qū)別考慮，而Stern－Volmer方程是假定結(jié)合位點(diǎn)數(shù)即是藥物分子實(shí)際結(jié)合在蛋白質(zhì)上的數(shù)量，這可能并不符合實(shí)際情況。Tachiya模型得到的結(jié)果更符合小分子與生物大分子相互作用的實(shí)際情況。

表4 通過(guò)Tachiya模型得到KF－BSA相互作用的結(jié)合參數(shù)Table 4 The binding parameters of KF－BSA system by Tachiya model

另外，由Tachiya模型得到的結(jié)合距離r與Stern－Volmer方程計(jì)算的結(jié)果亦有較大區(qū)別。但兩種方法計(jì)算出的結(jié)合距離r均在2～7 nm范圍內(nèi)，表明由藥物向BSA發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的幾率較大，具備了能量轉(zhuǎn)移猝滅蛋白質(zhì)熒光的條件，因此非輻射能量轉(zhuǎn)移是引起熒光猝滅的原因之一。

2.2.3 熱力學(xué)參數(shù)及作用力類型的求取 小分子和生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵、靜電作用、范德華力、疏水力4種［16］。假設(shè)在測(cè)定溫度范圍內(nèi)焓變變化不大，則焓變和熵變?chǔ)可以從Van t Hoff方程求得:

K近似于在相應(yīng)溫度下Stern－Volmer方程中相互作用體系的結(jié)合常數(shù)Ka，通過(guò)lnK對(duì)1/T作圖可以得到方程式:lnK=－21 635/T+84.870，r=0.998 6。根據(jù)該公式計(jì)算得到ΔH和ΔS，再由ΔG=－RTlnK計(jì)算ΔG，結(jié)果如表5所示。

Ross等［16］根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)出生物大分子與有機(jī)小分子等結(jié)合力性質(zhì)與結(jié)合作用熱力學(xué)函數(shù)之間的關(guān)系，根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)的相對(duì)大小，可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型:ΔH＞0，ΔS＞0為疏水作用力;ΔH＜0，ΔS＜0為氫鍵和范德華力;ΔH≈0，ΔS＞0為靜電引力。由表5可知，該反應(yīng)是自發(fā)反應(yīng)(ΔG ＜0);ΔH＞0，ΔS＞0，說(shuō)明KF與BSA之間的作用力為疏水作用力。

表5 KF－BSA相互作用的熱力學(xué)常數(shù)Table 5 The thermodynamic parameters of KF－BSA interaction

2.3 KF對(duì)BSA構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)的同步熒光光譜常被用來(lái)判斷蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。對(duì)于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜，Δλ=15 nm時(shí)只表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光，Δλ=60 nm時(shí)僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光。因?yàn)榘被釟埢淖畲鬅晒馀c其所處環(huán)境的疏水性有關(guān)，所以由熒光波長(zhǎng)的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化［17］。本實(shí)驗(yàn)固定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的間距為Δλ，同步掃描KF與BSA體系的同步掃描光譜以考察BSA的構(gòu)象變化(圖6)。

圖6 KF與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of interaction of KF with BSA A.Δλ =15 nm，B.Δλ =60 nm;cBSA=1.0×10－6mol·L－1;cKF=0.0－3.0(×10－6mol·L－1)

由圖6可觀察到，固定蛋白質(zhì)濃度，隨著KF濃度的增加，BSA分子中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光均被猝滅。KF使BSA的酪氨酸特征熒光峰發(fā)生了微弱的紅移，表明該殘基所處環(huán)境的疏水性減弱;色氨酸特征熒光峰發(fā)生了微弱的紫移，表明該殘基所處環(huán)境的疏水性有所增加，蛋白質(zhì)變得緊密［18］。KF的加入使BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化，推測(cè)KF與BSA的相互作用可能是通過(guò)與色氨酸殘基的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。

3 結(jié)論

利用熒光光譜與紫外可見(jiàn)吸收光譜研究了不同溫度下，KF與BSA之間的相互作用。使用Tachiya模型與Stern－Volmer方程，探討了兩種不同數(shù)學(xué)模型對(duì)相互作用體系計(jì)算結(jié)果的影響。結(jié)果表明，使用Tachiya模型時(shí)，結(jié)合常數(shù)Ka隨溫度的增加而增大，這種趨勢(shì)與Stern－Volmer方程得到的表觀結(jié)合常數(shù)的變化趨勢(shì)一致。但由Stern－Volmer方程得到的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)幾乎不隨著溫度變化而變化，而由Tachiya模型獲得的實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)數(shù)隨溫度的變化而發(fā)生明顯變化。Tachiya模型得到的結(jié)果更符合小分子與生物大分子相互作用的實(shí)際情況。熱力學(xué)數(shù)據(jù)表明KF與BSA之間主要依靠疏水作用力結(jié)合。同時(shí)同步熒光光譜發(fā)現(xiàn)KF與BSA的作用可能是通過(guò)與色氨酸殘基的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。

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