糧谷中8種痕量真菌毒素的定量分析方法

曹 婭，孫 利，王明林，馮 峰，儲(chǔ)曉剛*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018;2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 食品安全研究所，北京 100123)

真菌毒素是200多種真菌產(chǎn)生的次代謝的有毒物質(zhì)，可分為鐮刀菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬3種，能夠在寬泛的氣候條件下，生長(zhǎng)于田間或者貯藏過(guò)程中的農(nóng)作物上［1］。真菌毒素是一類分子量小于700的有毒化合物質(zhì)，存在于食品和飼料中，其一方面直接導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品腐敗變質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失以及產(chǎn)品的品質(zhì)降低等［2－4］，另一方面通過(guò)對(duì)任何動(dòng)物機(jī)體內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)和各種酶類的合成抑制以及對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞而引起真菌毒素中毒，真菌毒素對(duì)任何動(dòng)物的毒性都很高，通過(guò)吸入及皮膚接觸或攝入被污染的食物，可引起動(dòng)物病理變化和生理變態(tài)，引發(fā)包括中毒性肝損害、干細(xì)胞毒性、生殖紊亂、遺傳毒性、致癌作用、致畸作用和免疫抑制等中毒癥狀［5－6］。

當(dāng)前，針對(duì)真菌毒素常用的分析方法主要有薄層層析色譜法［7］、氣相色譜法［8］、液相色譜法［9］、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［10］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［11－14］和酶聯(lián)免疫吸附法［15］。薄層層析色譜法精確度低、操作較為復(fù)雜，近年來(lái)的應(yīng)用受到限制。免疫親和柱的價(jià)格昂貴，同時(shí)由于其高特異性的特點(diǎn)，無(wú)法進(jìn)行多殘留檢測(cè)。而氣相色譜法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)的范圍較窄，僅限于沸點(diǎn)較低的真菌毒素(如單端孢霉烯和棒曲霉素等)。液相色譜的應(yīng)用范圍雖然廣泛，但檢測(cè)的準(zhǔn)確度與靈敏度相對(duì)于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法較低，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。因此，多選擇性、高靈敏度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法成為近年來(lái)真菌毒素檢測(cè)的主要分析方法。

為了去除基質(zhì)干擾，提高方法的靈敏度，前處理方法的優(yōu)化必不可少。目前用于糧谷中真菌毒素的常規(guī)前處理方法有固相萃取法(SPE)［16］、液液萃取法(LLE)［17］等。但很少加入內(nèi)標(biāo)對(duì)方法進(jìn)行校正定量分析。本方法的基質(zhì)是糧谷，雜質(zhì)較多，干擾較大，而真菌毒素由于性質(zhì)各異，在前處理過(guò)程和電離過(guò)程中的損失需要用同位素內(nèi)標(biāo)來(lái)校正［18］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜法－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化前處理方法和色譜質(zhì)譜條件，首次建立了糧谷中8種真菌毒素的同位素內(nèi)標(biāo)稀釋定量法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(Agilent公司)，串聯(lián)API 5000三重四極桿質(zhì)譜儀(Applied Biosystem公司)，渦旋混合儀(Scientific Industries公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Avanti J-26 XPI離心機(jī)(Beckman Coulter公司)。

乙腈(HPLC級(jí)，Merck公司)，正己烷(HPLC級(jí)，Honeywell公司)，標(biāo)準(zhǔn)品(黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、柄曲霉素和異煙棒曲霉素 C)及同位素內(nèi)標(biāo)(黃曲霉毒素B113C17、黃曲霉毒素B213C17、黃曲霉毒素G113C17、黃曲霉毒素G213C17、伏馬毒素B113C34、伏馬毒素B213C34、柄曲霉素13C18和異煙棒曲霉素13C22)均購(gòu)于Biopure公司，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，電阻率大于18.2 MΩ·cm(Millipore公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、柄曲霉素和異煙棒曲霉素C用乙腈溶解，配成50 μg/L的儲(chǔ)備液;伏馬毒素B1和伏馬毒素B2用乙腈－水溶解，配成500 μg/L的儲(chǔ)備液;同位素內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液配制方法同上。最后用乙腈－水溶液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)，配制濃度依次為200、100、50、20、5、1 μg/L的工作液，置于4℃冰箱冷藏。

1.2 樣品前處理

稱取研磨好的糧谷樣品1.0 g(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入濃度為20 μg/kg的混合同位素內(nèi)標(biāo)，再加入5 mL正己烷和5 mL 60%乙腈，渦漩10 s，超聲5 min，在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，取1 mL乙腈水層樣液過(guò)0.2 μm的濾膜，待分析。

1.3 色譜－質(zhì)譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm);柱溫為25℃;流動(dòng)相A為0.1%乙酸，B為甲醇，流速為200 μL/min，梯度洗脫程序:0～20 min，50%～5%A;進(jìn)樣體積為5 μL。

電噴霧離子源(ESI):正離子模式;毛細(xì)管電壓:5.5 kV，氣簾氣:30 psi;霧化氣(Gas1):60 psi;輔助氣(Gas2):50 psi;離子源溫度:550℃。采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式，母離子/子離子對(duì)均設(shè)為單位分辨，各參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 ESI模式下各化合物的質(zhì)譜條件Table 1 MS/MS conditions in ESI mode for the detection of target compounds in standard solution

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

目標(biāo)樣品糧谷含有油脂類化合物，采用液液萃取的方式可將極性較強(qiáng)的真菌毒素萃取出來(lái)。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈、甲醇、水、乙腈水和甲醇水的萃取效果，在相同的樣品中加入最大濃度為10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果顯示當(dāng)以乙腈水作為提取溶劑時(shí)效果最好。為了保證目標(biāo)化合物的萃取回收率，本實(shí)驗(yàn)對(duì)乙腈水的混合比例以及不同的超聲萃取時(shí)間進(jìn)行了比較，在空白樣品中加入最大濃度為10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2”步驟處理，HPLC－MS/MS檢測(cè)分析。如圖1所示，當(dāng)乙腈與水的比例為6∶4時(shí)，8種真菌毒素的回收率最佳。由于各化合物極性差別較大，特別是伏馬毒素極性較大，提取溶劑中需含有適量的水，因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈 ∶水(6∶4)為最佳萃取溶劑。進(jìn)一步考察了萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果顯示，多數(shù)化合物的回收率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，但當(dāng)萃取時(shí)間大于5 min后，回收率提高不明顯，而延長(zhǎng)萃取時(shí)間也會(huì)產(chǎn)生熱使得化合物分解或產(chǎn)生其他變化，綜合考慮后選擇超聲萃取時(shí)間為5 min。

圖1 不同乙腈與水的比例下8種真菌毒素的回收率Fig.1 Recoveries of 8 types of mycotoxin in vary ratio of acetonitrile to water solvent

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于電噴霧質(zhì)譜是在溶液狀態(tài)電離，因此流動(dòng)相的組成除了影響分析物的保留時(shí)間和峰形外，還會(huì)影響分析物的離子化效率，從而影響目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于流動(dòng)相中不同有機(jī)溶劑(乙腈和甲醇)的種類進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示當(dāng)甲醇作為有機(jī)相時(shí)各化合物的峰形良好，離子化效率高于乙腈，因此有機(jī)相確定為甲醇。

考察了流動(dòng)相A的pH值在3.3～6.5范圍時(shí)對(duì)各化合物的離子化影響，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)pH值為3.3時(shí)，各化合物響應(yīng)較高，因此選擇pH 3.3的0.1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相。

圖2 不同流動(dòng)相下8種真菌毒素的色譜峰響應(yīng)Fig.2 Chromatographic response of 8 types of mycotoxin in vary of mobile phases

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過(guò)單個(gè)分析物標(biāo)準(zhǔn)品溶液上機(jī)分析，得到目標(biāo)分析物的質(zhì)荷比。為了進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行確證分析，在碰撞誘導(dǎo)解析電離模式(CID)下，通過(guò)分析單個(gè)目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，優(yōu)化了去簇電壓和碰撞電壓，得到離子豐度較大的碎片離子為該化合物裂解的主要碎片離子。表1為ESI模式下，各化合物的主要碎片離子的質(zhì)荷比。圖3為MRM模式下真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子流圖。

圖3 優(yōu)化條件下8種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of eight mycotoxin in optimum conditions

2.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

該實(shí)驗(yàn)中采用的同位素內(nèi)標(biāo)黃曲霉毒素B113C17、黃曲霉毒素B213C17、黃曲霉毒素G113C17、黃曲霉毒素G213C17、伏馬毒素B113C34、伏馬毒素B213C34、柄曲霉素13C18和異煙棒曲霉素13C22，各化合物的碳均為13C的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，它們?cè)诙ㄐ?、定量離子通道中相互無(wú)干擾，并且該內(nèi)標(biāo)物是人工合成，不存在于自然界中，為較好的內(nèi)標(biāo)物。但同位素內(nèi)標(biāo)難以得到，費(fèi)用極高。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了上述8種同位素內(nèi)標(biāo)和1種同位素內(nèi)標(biāo)(黃曲霉毒素B113C17)消除基質(zhì)干擾的回收率，加標(biāo)水平為各化合物的兩倍定量下限(內(nèi)標(biāo)混合液最大濃度為20 μg/L)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)分析的8種化合物極性差別較大，性質(zhì)各不相同，用同1種內(nèi)標(biāo)來(lái)消除干擾的分析結(jié)果并不理想。因此，最終將8種同位素內(nèi)標(biāo)都作為本實(shí)驗(yàn)的同位素內(nèi)標(biāo)物，用來(lái)同時(shí)對(duì)8種真菌毒素進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

表2 8種同位素內(nèi)標(biāo)和單一同位素內(nèi)標(biāo)(黃曲霉毒素B113C17)的加標(biāo)回收率對(duì)比Table 2 Comparison of recoveries between eight kinds of isotope internal standards and single isotope internal standard(AFB113C17) /%

2.5 線性方程與定量下限

配制質(zhì)量濃度為0.1～200 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)組分和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。8種真菌毒素在以上質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均不低于0.997 0。以信噪比為10計(jì)算方法的定量下限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)以及定量下限Table 3 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients(r)and limits of quantitation(LOQs)of eight target compounds

2.6 回收率與精密度

以各化合物的1倍、2倍定量下限(內(nèi)標(biāo)混合液最大濃度為20 μg/L)為3種空白樣品的加標(biāo)水平，在優(yōu)化條件下，每個(gè)樣品平行分析6次，計(jì)算回收率和精密度。各化合物的回收率為77%～123%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～13.3%(結(jié)果見(jiàn)表4)。

表4 8種化合物的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of eight target compounds(n=6) /%

2.7 實(shí)際樣品的篩查

按照本方法對(duì)超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買的大米、小麥和黃豆樣品進(jìn)行測(cè)定，每種樣品各3批，結(jié)果在小麥粉中檢出陽(yáng)性樣品，分別含有柄曲霉素0.73、0.33、0.49 μg/kg，但均未超過(guò)歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家的限量要求。

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