引起犬膿皮病皮膚表層細菌分離鑒定

管慶松 袁雪波 項勛 代飛燕* 肖嘯 （云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 云南 昆明 650201 云南省紅河州動物疫病預防控制中心 云南 蒙自）

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引起犬膿皮病皮膚表層細菌分離鑒定

管慶松①袁雪波②項勛①代飛燕①*肖嘯①（①云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 云南 昆明 650201 ②云南省紅河州動物疫病預防控制中心 云南 蒙自）

本試驗通過采集患犬表層膿液進行細菌分離和純化培養(yǎng)，之后在麥康凱、伊紅美藍、8.5%NaCl高鹽培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上做鑒別培養(yǎng)；結(jié)果23個樣本中有葡萄球菌9株、鏈球菌8株、大腸桿菌5株、其它雜菌1株；對分離得到的細菌做藥敏試驗，結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌、鏈球菌對頭孢孟多、慶大霉素、氟哌酸敏感，大腸桿菌對恩諾沙星、頭孢孟多、慶大霉素敏感。

犬膿皮病 細菌分離鑒定 藥敏試驗

犬膿皮病是危害犬較為嚴重的皮膚病之一。近年來，隨著人們的生活水平的迅速提高，寵物行業(yè)也不斷發(fā)展，犬膿皮病越來越多。所以對犬膿皮病病原菌的的研究也顯得格外的重要［1］?？股厝允悄壳爸委熑撈げ〉某Ｓ盟幬?，以抗生素為主的治療引起耐藥性問題，可能引起犬膿皮病難治愈及復發(fā)率高[2]。為了更好地控制犬膿皮病，試驗通過對患犬細菌分離鑒定及藥敏結(jié)果，篩選出主要的病原菌類型和最合理的抗生素藥物，為指導臨床科學用藥、有效降低犬膿皮病的發(fā)病率、更好地控制和治療犬膿皮病，促進寵物業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料采集 病料采自云南農(nóng)大動物醫(yī)院的患膿皮病犬，共采集病變部位膿液23份裝入滅菌瓶中并編號，置于4℃冰箱。

1.1.2 試驗試劑 中性紅、結(jié)晶紫、95%乙醇、碘液、麥康凱培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、NaCl、瓊脂粉等。

1.1.3 試驗儀器 4℃冰箱(5R1410)，日本三陽；多段可編程光照培養(yǎng)箱(PGX型)，寧波東南儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-g240A)，上海中支儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺(AIRTECH)，蘇靜集團安泰公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離培養(yǎng)和純化 先用劃線培養(yǎng)法將膿液在普通瓊脂培養(yǎng)基涂平，不能涂得太過密集，以免細菌長的太密集難以分到單個菌落。24h后在每個培養(yǎng)基上挑取幾個單個菌落于普通肉湯培養(yǎng)基上進行增菌培養(yǎng)。

1.2.2 染色、鏡檢 試驗采用革蘭氏染色法，首先將細菌在干燥的載玻片上涂勻并固定好，滴加草酸銨結(jié)晶紫作用2min后水洗，然后滴加革蘭氏碘液媒染2min后水洗，再以95%酒精脫色1min水洗，繼而滴加石碳酸復紅復染30s后水洗，最后等涂片干燥后拿于顯微鏡下觀察，經(jīng)初步鏡檢，發(fā)現(xiàn)疑似有鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌。將初步鏡檢后疑似大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌的菌落用相應的培養(yǎng)基進行鑒別培養(yǎng)[3]。

1.2.3 鑒別培養(yǎng) （1）鏈球菌的鑒別培養(yǎng)：在超凈工作臺上將樣品分別接種到血瓊脂培養(yǎng)基上，并且標明接種的編號。接種時用采樣的棉簽輕輕涂抹于培養(yǎng)基的一頭，之后用接種環(huán)以“Z”字型畫開，每涂過培養(yǎng)皿的一半時旋轉(zhuǎn)90°，接種環(huán)燒白滅菌后繼續(xù)沿“Z”字畫開。接種完成后將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。出現(xiàn)明顯的β溶血現(xiàn)象且呈灰白色初步判斷為化膿性鏈球菌，而無溶血現(xiàn)象呈黃色菌落初步判斷為金黃色葡萄球菌[4]。（2）葡萄球菌的鑒別培養(yǎng)：高鹽瓊脂培養(yǎng)基就是在普通培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加8.5%Nacl。用劃線法將細菌均勻的涂布于平板上，在此培養(yǎng)基上能夠生長的是葡萄球菌。（3）大腸桿菌的鑒別培養(yǎng)：采用劃線法將細菌分別涂于麥康凱瓊脂培養(yǎng)和伊紅美藍培養(yǎng)基上，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色菌落為陽性，伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上呈鐵銹色菌落為陽性，不生長為陰性［5］。

1.2.4 生化鑒定 使用凝固酶、麥芽糖、甘露醇、V-P試驗、透明質(zhì)酸、耐熱核酸酶、馬尿酸鈉、七葉苷、山梨醇、乳糖、葡萄糖、棉實糖、海藻糖、水楊苷、菊糖、棉子糖、蕈糖、山梨醇、8.5% NaC1、蔗糖等分別配制生化鑒定管。將培養(yǎng)皿中的典型菌種在超凈工作臺上接種至鑒定管中，置于37℃24h后觀察結(jié)果［6］。

1.2.5 藥敏試驗 選用頭孢孟多、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、氟哌酸、林可霉素、妥布霉素、恩諾沙星、菌必治等幾種常用藥物的藥敏試紙采用紙片擴散法[7]對分離菌株做藥敏試驗，測抑菌圈直徑(包括藥敏紙片直徑)，根據(jù)抑菌圈判斷實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的鑒別培養(yǎng)

將采集的樣本在普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)之后，挑取單個菌落接種到普通肉湯培養(yǎng)基，采用革蘭氏染色法初步判斷初球菌和桿菌，再通過鑒別培養(yǎng)基進行鑒定，能在麥康凱瓊脂培養(yǎng)和伊紅美藍培養(yǎng)基上生長，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色菌落為陽性，伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上呈鐵銹色菌落為陽性，不生長為陰性。結(jié)果分離到5株大腸桿菌。通過血瓊脂培養(yǎng)基和高鹽瓊脂培養(yǎng)基初步鑒定出9株疑似金黃色葡萄球菌，8株疑似化膿性鏈球菌，對疑似球菌的菌株做生化鑒定。

2.2 疑似葡萄球菌的生化鑒定

表1 疑似葡萄球菌生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性

表1結(jié)果表明，對能在高鹽培養(yǎng)基上生長的球菌做生化鑒定，有9株菌株符合金黃色葡萄球菌的生化特性。

2.3 疑似鏈球菌的生化鑒定

表2 疑似鏈球菌生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性

表2結(jié)果表明，對于不能于高鹽培養(yǎng)基上生長的球菌做生化鑒定，有8株菌株符合化膿性鏈球菌的生化特性。

2.4 所有病原菌的數(shù)量比例和分類

表3 犬膿皮病病原菌檢出結(jié)果

2.5 藥敏試驗結(jié)果

表4 三種細菌藥敏試驗結(jié)果 (mm)

由表3和表4可知，金黃色葡萄球菌和鏈球菌對頭孢孟多、慶大霉素、氟哌酸敏感，對慶大霉素、氯霉素、紅霉素已出現(xiàn)耐藥趨勢，對四環(huán)素、鏈霉素幾乎無效；大腸桿菌對恩諾沙星、頭孢孟多、慶大霉素敏感，對鏈霉素、菌必治、妥布霉素已出現(xiàn)耐藥趨勢，而對林可霉素幾乎無效。

3 討論

通過對犬膿皮病表層病原菌的分離鑒定。分離到3種主要致病菌，分別為葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌，說明葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌是目前造成犬膿皮病的主要致病菌種［8］。葡萄球菌、鏈球菌是條件性致病菌［9］，這與張緒洪等[8]報道的一致。葡萄球菌廣泛存在于周圍環(huán)境及人和動物的皮膚及粘膜，當有利繁殖的因素出現(xiàn)時，即會侵害犬的皮膚造成化膿感染，這就需要平時做好預防工作。當犬的皮膚發(fā)生病變時要考慮到繼發(fā)膿皮病的可能性，避免感染擴散造成嚴重的后果。

4 結(jié)論

昆明地區(qū)引起犬膿皮病的細菌主要是葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌。治療犬膿皮病時首選頭孢孟多、慶大霉素、恩諾沙星、氟哌酸等，且臨床用藥要注意按規(guī)定的劑量與療程使用，及時更換不同的敏感藥物進行治療，以免產(chǎn)生過多的耐藥現(xiàn)象。

[1] 閻繼業(yè). 畜禽藥物手冊[M]. 北京:金盾出版社, 2007, 107-112.

[2] 倪語星, 洪秀華. 細菌耐藥性監(jiān)測與抗感染治療[M]. 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2002.

[3] 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所. 獸醫(yī)微生物學[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1998. 143-156.

[4] 胡桂學. 獸醫(yī)微生物學實驗教程[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學出版社, 2006: 47-77.

[5] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學[M]. 北京農(nóng)業(yè)出版社, 2001. 199-238.

[6] 姚火春. 獸醫(yī)微生物學實驗指導[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001.

[7] 廖晚珍. 藥敏試驗的標準化及其進展[J]. 江西醫(yī)學檢驗, 1997, 15(4): 9.

[8] 張緒洪, 喻長發(fā), 趙吉剛. 犬膿皮病的診治研討[J]. 畜禽業(yè), 2007, 219(7): 46-47.

（2012–11–15）

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