牛傳染性鼻氣管炎的分離鑒定和滅活條件的優(yōu)化

梁宏儒，高佳濱，李安，陳為宏，喬波，尹輝，胡旭，趙達，姜東君，朱戰(zhàn)波

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319）

牛傳染性鼻氣管炎是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、鼻炎、鼻竇炎和上呼吸道炎癥為主要特征，還能引起母牛流產和產死胎、成年牛腸炎和犢牛腦炎，有時引起結膜炎和角膜炎，繼發(fā)性的細菌感染能導致更嚴重的呼吸道疾病[1-2]，世界動物衛(wèi)生組織將本病列為B 類疾病，也是我國進境動物的必檢疾病之一。牛傳染性鼻氣管炎病毒也稱牛皰疹病毒I 型（BHV-1），系球形有囊膜的雙股DNA 病毒，直徑約130～80 nm，對乙醚、氯仿、丙酮敏感。病毒在pH 6.9～9.0 時穩(wěn)定，在pH 4.5～5.0 下可被滅活。病毒在4 ℃可保存1 個月，-60 ℃可保存9 個月，37 ℃存活10 d 左右，對凍干、凍融也很穩(wěn)定，但在63 ℃以上數秒內可被滅活。目前通過基因分析和抗原鑒定一共發(fā)現3 種基因型：1、1.2 a、1.2 b。1 型病毒通常從侵染的鼻氣管中分離，并能夠從呼吸道和流產的胎兒中分離，該病毒主要流行于歐洲、北美和南美；1.2 a 型病毒能引起許多臨床疾病，如呼吸道疾病、陰道炎、流產和龜頭炎，目前多流行于巴西；1.2 b 型病毒與呼吸道疾病和陰道炎以及龜頭炎有關，但是不會導致流產[3]，致病力最弱。聚合酶鏈式反應（PCR）方法具有很高的靈敏度而能夠在檢測牛血清中微量的IBRV 的優(yōu)點。特別是對IBRV 的潛伏感染的確診，其特異性強。疫苗接種是最重要的預防和控制措施，其中滅活疫苗因在使用過程中具有較好的安全性，在種公牛、母牛和經濟價值高的奶牛群中得到廣泛應用[4]。

1 材料和方法

1.1 臨床癥狀

2012年12 月黑龍江某牛場奶牛突然發(fā)病，病牛主要表現為體溫升高、達41.5 ℃，精神萎頓，食欲減退近廢絕，產乳量急劇下降，呼吸加快，伴有咳嗽、流淚、大量黏膿性鼻汁，鼻黏膜發(fā)炎，鼻唇鏡高度充血呈紅色，依據臨床癥狀初步診斷為牛傳染性鼻氣管炎病毒感染。

1.2 病料的采集與處理

用無菌棉簽采集發(fā)病牛鼻腔分泌物，將牛鼻腔棉拭子放入裝有病毒分離運輸培養(yǎng)基的滅菌離心管中帶回實驗室。在超凈臺內將采集的牛鼻腔棉拭子用少量運輸培養(yǎng)基充分洗滌后，離心取上清液經0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，得到待分離病毒樣品，放入-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞

MDBK 細胞由本實驗室保存。

1.4 主要試劑

ExTaq 和dNTP 為TaKaRa 公 司 產 品；DNA Marker 為康為世紀科技（北京）有限公司產品；病毒基因組DNA 提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白酶、DMEM 為Gibco 公司產品；新生犢牛血清購自杭州四季青公司；甲醛為沈陽市華東試劑廠出品。

1.5 PCR 檢測

根據參考文獻[4]設計IBRV gB 基因序列引物，由上海生工生物技術有限公司合成。擴增片段大小為362 bp。引物序列為GH-1：GGCTCTACCGCACGGG CACCTCT，GH-2：GCGGCTCTCGTCTCGCAGCATTT。

按照天根生化科技（北京）有限公司病毒基因組DNA 提取試劑盒的操作步驟說明書提取病毒DNA模板。PCR 反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產物在EB 濃度為0.5 μL·mL-1的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 病毒分離

PCR 檢測陽性的樣品按照每孔100 μL 接種到長滿單層MDBK 細胞的6 孔板上，37 ℃吸附1 h，傾去液體，加入維持液（含青霉素200 U·mL-1、鏈霉素200 μg·mL-1和20 mL·L-1血清的MEM 培養(yǎng)液），同時設置未接種的正常細胞做對照。在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天早、中、晚3 次觀察細胞病變（CPE），待70%細胞出現CPE 時收毒，于-20 ℃反復凍融3 次，收毒后再傳代3 次使病毒增殖穩(wěn)定，于-70 ℃保存。如果細胞不出現CPE 時，盲傳3 代，觀察細胞病變。

1.7 分離病毒株組織細胞半數感染量（TCID50）的測定

取增殖性質穩(wěn)定的第4 代分離株病毒液100 μL用無血清的DMEM 培養(yǎng)液，在滅菌離心管中10 倍系列稀釋到10-8。在96 孔細胞培養(yǎng)板中四周各空一行，每個滴度6 個孔，每孔100 μL 稀釋的病毒液，設置一列僅加入維持液為陰性對照，然后每孔加入消化分散的MDBK 細胞懸浮100 μL，四周空白孔添加200 μL 無菌PBS，混勻后置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱觀察5 d，記錄細胞病變的孔數，按照Reed-Muench 法計算TCID50。

1.8 病毒滅活條件的優(yōu)化

1.8.1 毒液滅活濃度和時間的篩選

每瓶病毒液中分別加入不同濃度的甲醛溶液，先用PBS 溶液（平衡液）將40%的甲醛溶液稀釋為10%的甲醛溶液。然后根據要求向病毒液中緩慢加入10%的甲醛稀釋液，混合液甲醛溶液的終濃度（V/V）分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，充分振蕩混勻后放置37 ℃恒溫箱中進行滅活。不同甲醛濃度的病毒液分別在37 ℃滅活12、24、36、48 h 后進行滅活效果檢驗。在滅活過程中，振搖病毒液數次。然后，進行無菌檢驗，確定甲醛溶液滅活的最佳濃度和時間。

1.8.2 滅活效果的檢驗

滅活后，取病毒懸液接種于單層的MDBK 細胞，加入含2%新生犢牛血清的維持液并觀察4 d。4 d 后如未觀察到細胞病變（CPE），以相同方法進行第2 代盲傳，繼續(xù)觀察4 d，如仍未見CPE 表明病毒液滅活完全。

2 結果

2.1 PCR 檢測結果

樣品細胞培養(yǎng)液的PCR 擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在362 bp 處出現明顯條帶，片段大小與預期相符，說明該細胞培養(yǎng)液IBR 陽性。如圖1 所示：

圖1 IBRV gB 基因序列PCR 擴增Fig.1 The glycoproteinB（gB）gene of the infectious bovine rhinotracheitis virus

2.2 病毒分離和增殖結果

病毒株盲傳一代18 h 后就出現細胞病變（CPE）現象，即細胞變圓和中間空洞的蜘蛛網狀。有些呈聚集成葡萄串樣，有些呈散在排列，有些卷縮成塊飄落在培養(yǎng)液中。

病毒接種24 h 后，細胞出現圓縮，32 h 出現明顯CPE，48 h 超過70%的細胞出現CPE（圖2），說明MDBK 細胞對于IBRV 較為敏感，可以用于病毒增殖相關試驗研究。

2.3 TCID50 檢測結果

采用Reed-Muench 法測定該分離株病毒的TCID50 為10-5.5·0.1 mL-1。

圖2 IBRV 病毒在MDBK 細胞Fig.2 IBRV virus in MDBK cells

2.4 滅活效果檢驗結果

滅活后病毒樣品接種96 孔板MDBK 細胞，分別于12、24、36、48 h 觀察細胞病變情況。結果顯示：終濃度為0.1%的甲醛溶液滅活48 h 后未滅活完全，終濃度為0.2%的甲醛滅活36 h 后滅活完全，終濃度為0.3%的甲醛滅活24 h 后滅活完全，終濃度為0.4%的甲醛滅活18 h 后滅活完全。結合TCID50 的測定結果，選擇用0.2%甲醛滅活的病毒接種未發(fā)生病變的MDBK 細胞以相同方法進行第2 代盲傳，繼續(xù)觀察4 d，仍未見CPE，效果較好。

3 討論

從20 世紀50 年代初發(fā)現本病至今，各大洲都有發(fā)生的報道，IBR 在全球范圍內廣泛存在。病畜及帶毒畜為主要傳染源。牛感染該病后，在自然條件下可不定期排毒，這對該病的傳播流行起著重要的作用[5]。IBRV 在致病性方面最大的特點是其組織嗜性寬廣，除侵害呼吸系統(tǒng)外，還能侵襲多種器官和組織，引起多種臨床癥狀[6]，給養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經濟損失，是進口牛和精液時經常關注的一種疫病。

根據臨床癥狀，病理變化和流行病學可作出初步診斷，但是若要確診IBRV 感染，尤其在新發(fā)生地區(qū)，必須依靠實驗室診斷方法。常用的實驗室診斷方法有：病原分離鑒定、包涵體檢查、病毒鑒定與檢測、特異性抗體的檢測（血清中和試驗、酶聯免疫吸附試驗、瓊脂擴散試驗、間接血凝試驗、變態(tài)反應）。檢測IBRV 抗原和抗體的方法很多，但存在不同程度的缺陷?；驒z測靈敏度不夠，或費時費力，或有假陽性出現。隨著分子生物學技術的發(fā)展，特別是以PCR 為基礎的各種檢測方法提高了檢測的敏感度和準確度，縮短了檢測時間，彌補了原有的血清學檢查方法的眾多缺陷[7]。常用的分子生物學診斷方法有：聚合酶鏈式反應、核酸探針法、限制性核酸內切酶分析。

牛腎細胞對酸性環(huán)境的耐受性小，在pH 6.6～6.8的營養(yǎng)液或維持液中培養(yǎng)，易于衰老死亡，尤其初代培養(yǎng)細胞對酸性環(huán)境更為敏感，培養(yǎng)過程中應注意pH 值的調節(jié)。細胞在有營養(yǎng)液或維持液保護的環(huán)境中，對低溫和高溫的耐受力均強，在無營養(yǎng)液保護時，對溫度特別是對低溫十分敏感，尤其是低溫溶液直接作用于細胞，可迅速引起圓縮，拉網，甚至完全脫落死亡[8]。

實驗中發(fā)現IBRV 接種于細胞單層后，前幾代往往不到24 h 就都脫落了，但隨著傳代次數的增加，病變和脫落的時間會相對穩(wěn)定在24～48 h，這是因為前幾代時病毒還不適應細胞。等適應后會逐漸穩(wěn)定下來，實驗中接毒后病毒在細胞上吸附的時間也很重要，吸附時間短，病毒和細胞沒有充分的結合，因而得到的病毒含量也會降低。通過實驗我們認為接毒后吸附1.5 h，病毒才能充分與細胞相結合，這樣獲得的病毒液的病毒含量較高。

滅活方法的研究首先需確定考察指標，然后據此選擇合理的滅活劑種類及其濃度及滅活的時間。甲醛和β-丙內酯均常用于滅活疫苗的生產。甲醛滅活病毒的原理是甲醛的醛基作用于微生物的氨基產生經甲基氨，作用于梭基形成亞甲基二醇單醋，作用于經基生成經基甲酚，作用于硫基形成亞甲基二醇，在這種情況下經甲基代替敏感的氫原子破壞生命的基本結構導致微生物死亡，但不明顯影響其免疫原性[9]。滅活病毒可用質量分數為0.05%～0.4%，常用質量分數為0.1%～0.3%，處理條件為37～39 ℃24 h 以上[10]。而β-丙內酯（BPL）在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活，對病毒具有很強的滅活作用。直接作用于病毒核酸，保持免疫原性，強滅活效果；極易水解，無殘留，并且水解產物無毒無害。滅活時間短，縮短了疫苗的生產周期，提高了經濟效益。但與甲醛相比，如用β-丙內酯應使用98%以上濃度的新試劑，β-丙內酯保存時間過長引起自身聚合，影響滅活效果且β-丙內酯價格明顯昂貴，不適用于發(fā)展中國家或經濟落后國家。

病毒滅活后驗證其滅活效果應同時考慮滅活效果和滅活方法及參數對產品質量的影響兩方面的驗證，應采用最敏感的檢測方法來驗證無活病毒?？芍苯硬捎脛游锓ǎ^察接種動物的存活情況，也可采用敏感細胞盲傳2 代，對每代細胞進行檢測，同時還要驗證滅活條件對疫苗抗原含量、效價等的影響。

4 結論

PCR 檢測方法特異快速的檢測出樣品為陽性，即樣品中存在牛傳染性鼻氣管炎病毒。對增殖后的牛傳染性鼻氣管炎病毒分別用0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的甲醛滅活后于12、24、36、48 h 接種于MDBK細胞觀察細胞病變情況，比較后的研究結果表明，濃度為0.2%的甲醛在37 ℃滅活36 h 對牛傳染性鼻氣管炎病毒的滅活效果最好。

［1］ 殷震，劉景華.動物病毒學［M］.2 版.北京：科學出版社，1997.

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［5］ 陳婷. 牛傳染性鼻氣管炎病毒gD 基因原核表達及間接ELISA 檢測方法的建立［D］.楊凌：西北農林科技大學，2012.

［6］ 李玉恒，趙明慧，趙紫陽，等.利用梯度PCR 和降落PCR擴增CIRP 基因的比較［J］.黑龍江八一農墾大學學報，2011，23（5）：43-46.

［7］ 王冰. 針對gG 基因的牛傳染性鼻氣管炎病毒新型檢測方法建立和應用［D］.武漢：華中農業(yè)大學，2011.

［8］ 王延濤. 牛傳染性鼻氣管炎病毒分離鑒定及其單克隆抗體制備［D］. 大慶：黑龍江八一農墾大學，2008.

［9］ 張穗.福爾馬林沉淀的簡易解聚法［J］.中國消毒學雜志，1990，7（1）：30.

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