外源Toll 樣受體2 轉(zhuǎn)基因綿羊的構(gòu)建與鑒定

張弘韜，潘求真，馮國(guó)興，鄧守龍，連正興

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

Toll 樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）是Toll樣受體家族的一種受體，研究結(jié)果表明TLR2 識(shí)別的病原配體種類最多。TLR2 作為一種廣譜病原相關(guān)分子模式識(shí)別受體，能識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[1]，還能識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、結(jié)核桿菌、螺旋體以及支原體等，它在多種病原微生物所引起的感染中均起重要作用，被歸屬為中樞性模式識(shí)別（Central pattern recognition）受體，受到高度的關(guān)注[2]。而且，TLR2 具有很大數(shù)量的配體，這些配體可以通過TLR2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)激活免疫系統(tǒng)，它參與炎癥因子其釋放的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，能夠激活先天性免疫以及獲得性免疫[3]。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指將外源基因穩(wěn)定整合到自身染色體內(nèi)并能穩(wěn)定遺傳的一類動(dòng)物。原核顯微注射法是直接把DNA 注射到受精卵的原核中。Gordon 等[4]首次采用原核顯微注射法將外源基因?qū)胄∈蟮氖芫?。此后Hamme 等[5]將鼠的金屬硫蛋白基因和人生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入綿羊中，成功獲得了使用顯微注射法制備的世界上第一只轉(zhuǎn)基因羊。

原核顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因羊包括以下主要程序：首先制備具有良好表達(dá)活性的目的基因，然后用顯微注射裝置把目的基因?qū)氲窖虻氖芫研坌栽?，將含有外源基因的受精卵移植入到受體母羊的輸卵管，再經(jīng)過妊娠和分娩，最后獲得后代。這種方法可靠且重復(fù)性好，但其制作效率很低[5]。因?yàn)檫@種整合方法具有較大的隨機(jī)性，不能夠進(jìn)行定點(diǎn)整合。當(dāng)外源基因被注入到原核后，可以插入到受體染色體基因組的任何一個(gè)部位，而且是完全隨機(jī)，這就導(dǎo)致基因的表達(dá)以及遺傳的穩(wěn)定性得不到保證，從而造成子代非轉(zhuǎn)基因個(gè)體較多。因此，對(duì)轉(zhuǎn)基因子代的檢測(cè)與鑒定尤為重要。

通過顯微注射的方法對(duì)綿羊進(jìn)行外源基因TLR2 整合，通過PCR、Southern blotting、Real time PCR 對(duì)其進(jìn)行鑒定，確認(rèn)TLR2 轉(zhuǎn)基因綿羊，為通過轉(zhuǎn)基因綿羊模型研究TLR2 基因在綿羊抗病中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 3S-Loxp-TLR2 載體的構(gòu)建

摘取剛宰殺的綿羊的脾臟，放入液氮中保存然后帶回實(shí)驗(yàn)室。參照試劑盒的說明書用EASYspin 組織/細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒（RNA kit，OMEGA）提取總RNA。采用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（Promega）按其操作說明進(jìn)行cDNA 合成。根據(jù)NCBI 上發(fā)表TLR2基因（GenBank ID∶GU984 768.1）序列，使用primer 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物用于綿羊TLR2 基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建，上游引物加上酶切位點(diǎn)XhoI 和保護(hù)性堿基taa；下游引物加上酶切位點(diǎn)BmaI 和保護(hù)性堿基ta；引物是由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：Sheep TLR2-F：5'-TAA CTC GAG ATG CCA CGT GCT TTG TGG AC-3'，Sheep TLR2-R：5'-TAG GAT CCC TAG GAC CTT ATT GCA GCT C-3'。

切除載體pEGFP-N1 中的EGFP，得到載體pN1，在pN1 兩側(cè)分別連接一個(gè)LoxP，再與載體pIRES2-EGFP 進(jìn)行連接，得到3S-Loxp 的質(zhì)粒。將3S-Loxp 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃恒溫?fù)u床過夜培養(yǎng)后，使用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。用XhoI、BmaI 兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切T- TLR2質(zhì)粒和3S-Loxp 質(zhì)粒，膠回收后連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，然后挑取單菌落37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)。取5 mL 菌液提取質(zhì)粒，然后-20 ℃保存?zhèn)溆?。雙酶切鑒定及測(cè)序后正確的質(zhì)粒進(jìn)行大量擴(kuò)增提取[6]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因注射

提純3S-Loxp-TLR2 質(zhì)粒，顯微注射到綿羊精卵雄核，注射后在M16 繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好的卵移卵于綿羊輸卵管中。注射羊?yàn)? 年齡杜寒雜交羊，體重為50 kg 左右，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物擴(kuò)繁工作于2010～2012 年在天津試驗(yàn)羊牧場(chǎng)完成。非轉(zhuǎn)基因普通奶綿羊?yàn)樵撛囼?yàn)羊牧場(chǎng)同種綿羊。

1.3 TLR2 轉(zhuǎn)基因羊的PCR 鑒定

轉(zhuǎn)基因羊與非轉(zhuǎn)基因羊均為6 月齡杜寒雜交羊，體重為25 kg。分別對(duì)每只待測(cè)羊剪耳采樣，采用分子克隆實(shí)驗(yàn)指南的酚-氯仿抽提方法提取DNA，使用Thermo 公司的DreamTaq 酶進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR檢測(cè)設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，第一對(duì)引物的上游引物位于CMV 片段上，下游引物位于TLR2 片段上，第二對(duì)引物的上游引物位于TLR2 片段上，下游引物位于SV40 片段上。引物序列分別為：cmvTLR2F：5′-TGT TCC CAT AGT AAC GCC AAT A-3′，cmvTLR2R：5′-ACA GAG AAG AAG CCT GAT GAG AG -3′；TLR2sv40F：5′-TTC TCC CAC TTC CGT CTC-3′，TLR2sv40R：5′-CCC TAT CTC GGT CTA TTC TT-3′，擴(kuò)增的目的片段約565 bp 和618 bp。PCR 擴(kuò)增體系：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%Agrose、120 V 條件下電泳20 min 后拍照鑒定。兩對(duì)PCR 結(jié)果都呈陽(yáng)性的個(gè)體，為整合轉(zhuǎn)基因羊。

1.4 TLR2 轉(zhuǎn)基因羊的Southern blot 鑒定

采用DIG（Roche）標(biāo)記，用PCR 方法擴(kuò)增作為探針。20 μg 基因組DNA 分別加入6 μL 的內(nèi)切酶NdeI、HindⅢ-HF，總體積200 μL，37 ℃消化過夜。真空干燥濃縮至50 μL，0.8%瓊脂糖膠分離酶處理的DNA，轉(zhuǎn)移到Hybond-N＋尼龍膜（GE Healthcare Life Sciences 產(chǎn) 品，RPN303B），UV 交 聯(lián) 儀 固 定。用15 mL Dig Easy Hyb granules（Roche）進(jìn)行預(yù)雜交，用DIG 標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交。用含有2×，0.5×SSC，0.1% SDS 溶液洗滌濾膜，X 光片曝光處理。

1.5 轉(zhuǎn)基因羊的TLR2 表達(dá)量的測(cè)定

采集轉(zhuǎn)基因羊與對(duì)照羊血液，分離單核細(xì)胞，提取RNA（TRIzol Reagent，Invitrogen），反轉(zhuǎn)錄成cDNA（Thermo）。采用時(shí)實(shí)定量PCR 法測(cè)定轉(zhuǎn)基因羊與對(duì)照羊的TLR2 表達(dá)量。定量PCR 引物的設(shè)計(jì)與序列根據(jù)外源基因的堿基序列，利用軟件Primer 5 設(shè)計(jì)。引物：F：5′- TGC TGT GCC CTC TTC CTG TT-3′；R：5′GGG ACG AAG TCT CGC TTA TGA A-3′。

反應(yīng)于Agilent Stratagene 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（吉泰生物有限公司）。25 μL 反應(yīng)體系的包括：引物0.3 μM，模版1 μL，2 × SRBR Green Mix 12.5 μL，補(bǔ)水至25 μL，按照如下的程序進(jìn)行反應(yīng)：95 ℃10 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃20 s，共40 循環(huán)。轉(zhuǎn)基因羊TLR2 基因表達(dá)量的定量分析按照Karsai 的方法[7]進(jìn)行。采用相對(duì)定量法計(jì)算目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的變化倍數(shù)[8]，β-actin 為內(nèi)參基因。用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可計(jì)算出樣品的起始拷貝數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SAS 9.1 進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建的3S-Loxp-TLR2 重組載體的酶切鑒定

3S-Loxp-TLR2 載體如圖（圖1）所示。用XhoI 和BamHI 對(duì)3S-Loxp-TLR2 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后電泳，結(jié)果顯示3S-Loxp-TLR2 酶切為兩條帶，大小別為2.35 kbp 和5.3 kbp （圖2）；結(jié)果表明構(gòu)建的3S-Loxp-TLR2 重組載體正確。

2.2 TLR2 轉(zhuǎn)基因羊的PCR 鑒定

將p3S-LoxP-TLR2 質(zhì)粒AseI 酶切線性化，經(jīng)純化和稀釋為5 ng·μL-1后作為顯微注射用的DNA。共注射148 個(gè)受精卵，移植到41 只受體羊中，共產(chǎn)下15 只小羊。第一對(duì)引物跨MCV 和TLR2，第二對(duì)引物跨TLR2 和SV40，所以野生型羊不會(huì)有擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因成功羊產(chǎn)物約為565 bp和618 bp（圖3，圖4），且在15 個(gè)小羊中有9 只小羊的PCR 擴(kuò)增出現(xiàn)目的條帶。

圖2 XhoI 和BamHI 雙酶切質(zhì)粒結(jié)果Fig.2 p3S-LoxP-TLR2 plasmids digestion result by XhoI and BamHI

圖3 引物為cmvTLR2F/R 轉(zhuǎn)基因羊的PCR 結(jié)果Fig.3 Result of transgenic sheep by PCR of primer cmvTLR2F/R

圖4 引物為TLR2sv40F/R 轉(zhuǎn)基因羊的PCR 結(jié)果Fig.4 Result of transgenic sheep by PCR of primer TLR2sv40F/R

2.3 TLR2 轉(zhuǎn)基因羊的Southern blot 鑒定

以不同拷貝數(shù)的p3S-LoxP-TLR2 質(zhì)粒對(duì)照，對(duì)導(dǎo)入綿羊中的目的TLR2 基因進(jìn)行Southern blot 分析，并檢測(cè)其拷貝數(shù)。Southern 雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR 檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)TLR2 小羊的基因組中8 只整合了TLR2基因，且均為單拷貝（圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)基因羊的Southern 分析Fig.5 Southern analysis of transgenosis sheep

2.4 轉(zhuǎn)基因羊的TLR2 表達(dá)量的測(cè)定

采用時(shí)實(shí)定量PCR 方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因羊TLR2 表達(dá)量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因羊的TLR2 mRNA 表達(dá)明顯高于對(duì)照（P＜0.05）（圖6）。結(jié)果還顯示，在轉(zhuǎn)基因羊之間無明顯表達(dá)差異，在非轉(zhuǎn)基因內(nèi)也無明顯表達(dá)差異，但在轉(zhuǎn)基因羊與非轉(zhuǎn)基因羊間有明顯表達(dá)差異。

圖6 相對(duì)定量檢測(cè)TLR2 mRNA 的表達(dá)Fig.6 Relative quantitative analysis of TLR2 mRNA expression

3 討論

實(shí)驗(yàn)中所用的載體是由pIRES2-EGFP 質(zhì)粒改造而成，命名為3S-Loxp。該載體全長(zhǎng)為5.3 kb，其含有SV40 early ployA 信號(hào)序列、SV40 復(fù)制起始位點(diǎn)、SV40 早期啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子（Human cytomegalovirus immediate earlypromoter，pCMV）、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（Internal ribosome entry site，IRES）、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、卡那和新霉素抗性基因和pUC 質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)。這個(gè)載體能夠在大腸桿菌中高拷貝復(fù)制，而且在多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞中也能高效表達(dá)。3S-Loxp 載體因?yàn)閹в蠸V40 早期啟動(dòng)子和pCMV 啟動(dòng)子，它們都是組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，因此3S-Loxp 載體的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)比較恒定。又因?yàn)檫@些啟動(dòng)子在動(dòng)物細(xì)胞中沒有明顯的調(diào)節(jié)控制因子，所以它的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)很少受到其他調(diào)控因素的干擾。這個(gè)表達(dá)載體還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗芯G色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因，利用這個(gè)蛋白可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白的表達(dá)并定位。另外，該載體還帶有一個(gè)篩選標(biāo)記（新霉素抗性基因，Neor），可以用G418 來對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行篩選，從而鑒定轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞。此外，3S-Loxp 載體上還有保證轉(zhuǎn)基因安全性的兩個(gè)序列，即兩個(gè)同方向的Loxp 序列，如果用Cre 酶處理后可以從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中去除外源基因以外的其他序列。

實(shí)驗(yàn)中共注射14 個(gè)受精卵，移植到41 只受體羊中，共產(chǎn)下15 只小羊，其中8 只小羊?yàn)槌晒D(zhuǎn)基因羊，轉(zhuǎn)基因率為53%。顯微注射法是目前制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用較為廣泛的一種方法，但其存在的主要問題是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成活率低，其成活率小鼠為2.6%、大鼠4.4%、兔1.5%、羊0.9%、豬0.7%、牛0.7%。本研究轉(zhuǎn)基因率較高的原因可能與使用的質(zhì)料特點(diǎn)和基因類型有關(guān)，這有待于進(jìn)一步研究。

外源基因的表達(dá)水平是決定轉(zhuǎn)基因效果的重要因素，通常外源基因的表達(dá)水平受到多種因素的影響而在一個(gè)較大的范圍內(nèi)變動(dòng)。Schoneveld 等[9]研究表明TLR2 識(shí)別鏈球菌的脂蛋白和脂磷壁酸，TLR6和TLR2 共同識(shí)別鏈球菌肽聚糖，TLR2 mRNA 水平的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間和劑量的依賴性；董靜等[10]研究表明小鼠感染肺炎衣原體后肺組織TLR2 mRNA 表達(dá)迅速升高，以第4 d 和第7 d 明顯，14 d 以后開始下降。Shoulong Dong 的研究表明[11]，Pam3CSK4 刺激山羊單核細(xì)胞后2 h 時(shí)轉(zhuǎn)基因羊的TLR2 mRNA 表達(dá)量最高，刺激后8 h 時(shí)最低，而對(duì)照羊TLR2 mRNA 表達(dá)量在各檢測(cè)時(shí)間段變化不大，幾乎沒有表達(dá)上的時(shí)間差異性。這與Schoneveld 等、董靜等的研究結(jié)果不同。這可能與動(dòng)物種類、刺激物及劑量、刺激方式等不同有關(guān)，還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

通過顯微注射的方法對(duì)綿羊進(jìn)行外源基因TLR2 整合，通過PCR、Southern blot、Real time PCR對(duì)其進(jìn)行鑒定、拷貝數(shù)驗(yàn)證和表達(dá)量分析。結(jié)果表明，注射148 個(gè)受精卵，共產(chǎn)下15 只小羊，其中8 只小羊檢測(cè)為陽(yáng)性；Southern 雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)TLR2 小羊的基因組中外源TLR2 基因均為單拷貝；定量結(jié)果轉(zhuǎn)基因羊TLR2 mRNA 表達(dá)明顯高于對(duì)照（P＜0.05）。

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