紫花苜蓿莖尖離體再生體系的建立

郭永霞，孫強(qiáng)，王麗艷，荊瑞勇，殷奎德

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

紫 花 苜 蓿（Medicago sativa L.） 屬 于 豆 科（leguminosae）苜蓿屬多年生牧草作物，因其品質(zhì)優(yōu)良而成為世界上種植面積最大并且經(jīng)濟(jì)效益最高的牧草[1]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行品種改良，成為目前紫花苜蓿研究領(lǐng)域的新方向和熱點(diǎn)[2]。1972 年，美國(guó)學(xué)者Saunders 等[3]利用苜蓿子房、未成熟的花藥、子葉誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)一步誘導(dǎo)分化，成功獲得再生植株，標(biāo)志著苜蓿再生體系研究的開(kāi)始。由于基因的遺傳轉(zhuǎn)化多采用愈傷組織進(jìn)行，因此通過(guò)愈傷組織進(jìn)行再生體系建立研究的比較多[4-6]。但其有一個(gè)弊端就是轉(zhuǎn)基因成功后不能直接進(jìn)行快速繁殖，如果能夠利用莖尖進(jìn)行快速繁殖則能夠有效的解決這一問(wèn)題，因此試驗(yàn)利用紫花苜蓿無(wú)菌苗莖尖為材料，建立離體再生體系，為轉(zhuǎn)基因后植株的快速繁殖奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿成熟種子，“敖漢苜蓿”，取自黑龍江省畜牧研究所。

1.2 消毒方法

選取健康飽滿(mǎn)的紫花苜蓿種子，首先用75%的乙醇浸泡30～45 s，將乙醇倒出后加入0.1%的升汞浸泡10 min，倒掉后用無(wú)菌水沖洗4～5 次，備用。

1.3 無(wú)菌苗的獲得

將消毒好的種子接種到MS 培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)獲得無(wú)菌苗。

1.4 莖尖的分化增殖

將無(wú)菌苗莖尖切下后接種到莖尖分化增殖培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)采用在MS 培養(yǎng)基中分別添加6-BA 的濃度為0.5、1.0 、1.5、2.0 mg·L-1；NAA 的濃度為0.05 、0.1 、0.2、0.5 mg·L-1；最適激素濃度配比的篩選采用二因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)進(jìn)行，總計(jì)16 個(gè)處理組合（見(jiàn)表1）。將種子萌發(fā)得到的無(wú)菌苗的莖尖切下后接入到表1 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶接種4 個(gè)莖尖，每個(gè)處理總計(jì)接種40個(gè)莖尖。30 d 后統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)。以增殖系數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行來(lái)最適培養(yǎng)基的篩選。增殖系數(shù)=分化出芽的總數(shù)/莖尖總個(gè)數(shù)。

1.5 組培苗生根

將分化出的叢生芽分成單株，接種在生根培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)采用在MS 培養(yǎng)基中分別附加0 、0.01 、0.05、0.10 mg·L-1IBA，每個(gè)處理接種20 瓶，每瓶接種1 株，每個(gè)處理總計(jì)接種20 株。20 d 后統(tǒng)計(jì)側(cè)根的條數(shù)及生根率。

1.6 培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基皆以濃度為0.8%的植物瓊脂固化，加入的蔗糖濃度為3%，在高溫高壓滅菌前將pH 值調(diào)至5.8，培養(yǎng)室的溫度為（25±2）℃。光照強(qiáng)度為1 500～2 000 Lx，每天光照時(shí)數(shù)為12～14 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽獲得無(wú)菌苗

將滅好菌的種子在超凈工作臺(tái)中接種到MS 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況。結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)7 d 時(shí)，發(fā)芽率達(dá)到了100%，并且無(wú)菌苗長(zhǎng)勢(shì)良好，沒(méi)有污染（見(jiàn)圖1）。

圖1 紫花苜蓿種子發(fā)芽Fig.1 Buds of Medicago sativa L.

2.2 紫花苜蓿莖尖分化增殖培養(yǎng)

將由種子發(fā)芽獲得的無(wú)菌苗莖尖切下，接種到添加不同激素濃度配比的處理組合中，培養(yǎng)30 d 后，莖尖分化出叢生芽（見(jiàn)圖2），對(duì)其進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 紫花苜蓿莖尖分化增殖Fig.2 Differentiation and proliferation of Medicago sativa L. stem tip

表1 植物激素配比對(duì)紫花苜蓿莖尖分化增殖培養(yǎng)的影響Table 1 Effects of plant hormon ratio on proliferation of Medicago sativa L. stem tip

續(xù)表1 植物激素配比對(duì)紫花苜蓿莖尖分化增殖培養(yǎng)的影響Continued table1 Effects of plant hormon ratio on proliferation of Medicago sativa L. stem tip

從表1 可以看出，在處理1～4 培養(yǎng)基中紫花苜蓿莖尖的增殖系數(shù)為0，即不能分化增殖，而在處理5～16的培養(yǎng)基上紫花苜蓿均有不同程度的分化增殖，但增殖系數(shù)各不相同，其中處理10 的增殖系數(shù)最大為6.25，其次是處理11，增殖系數(shù)為5.85，從方差分析可以看出處理10 與處理11 之間差異不顯著，而兩個(gè)處理與其他各處理之間差異達(dá)顯著。從表中還可以看出，兩種激素即6-BA 和NAA 對(duì)紫花苜蓿的增殖系數(shù)均產(chǎn)生一定的影響，其中當(dāng)6-BA 的濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，無(wú)論NAA 的濃度是多少紫花苜蓿莖尖的增殖系數(shù)均為0。當(dāng)6-BA 的濃度增大到1.0～2.0 mg·L-1時(shí)，紫花苜蓿均有不同程度的增殖，當(dāng)濃度為1.5 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)均較高；在此6-BA 濃度下，NAA 的濃度對(duì)增殖系數(shù)也有一定的影響，當(dāng)濃度在0.05～0.2 mg·L-1范圍內(nèi)，隨著NAA 濃度的增加增殖系數(shù)呈先增大后降低的趨勢(shì)。當(dāng)NAA 濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)最大。因此試驗(yàn)篩選出紫花苜蓿莖尖分化增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。紫花苜蓿分化增殖情況見(jiàn)圖2。

2.3 紫花苜蓿組培苗生根

選擇增殖培養(yǎng)后生長(zhǎng)健壯的試管苗，將試管苗分成單株，分別接種到不同的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，20 d 時(shí)觀察生根情況并統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，IBA 的濃度以0.05 mg·L-1為最佳，平均側(cè)根數(shù)最多為28.5 條，平均生根率也最大達(dá)到93.5%。從方差分析可以看出，在此濃度下的平均側(cè)根數(shù)以及平均生根率與其他各濃度差異均達(dá)到顯著水平，因此篩選出的最適生根培養(yǎng)基為MS+IBA0.05 mg·L-1。紫花苜蓿生根情況見(jiàn)圖3。

圖3 紫花苜蓿生根情況Fig.3 Rooting conditions of Medicago sativa L.

表2 生長(zhǎng)素對(duì)紫花苜蓿組培苗生根的影響Table 2 Effects of NAA on rooting of seeding in tissue culture

3 結(jié)論

紫花苜蓿莖尖分化增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1，平均增殖系數(shù)為6.25；紫花苜蓿組培苗生根的最適培養(yǎng)基為MS+IBA0.05 mg·L-1，平均側(cè)根數(shù)為28.5 條，平均生根率達(dá)到93.5%。以往進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)主要是利用下胚軸為材料，通過(guò)誘導(dǎo)愈傷組織，完全脫分化后，再進(jìn)一步進(jìn)行分化增殖的[4-7]，而利用莖尖做材料進(jìn)行增殖培養(yǎng)的研究鮮有報(bào)道。試驗(yàn)中以紫花苜蓿的莖尖為試驗(yàn)材料，進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)，分化形成大量的叢生芽，增殖系數(shù)最大為6.25。雖然增殖系數(shù)不太高，但培養(yǎng)周期短，并且能夠培養(yǎng)增殖多代，為通過(guò)基因工程進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)基因植株的快速繁殖奠定了基礎(chǔ)。

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