頭穴叢刺對(duì)抑郁模型大鼠下丘腦CRF表達(dá)的影響*

鄭祖艷，徐博佳，周麗穎，吳明娟

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)研究院，黑龍江哈爾濱150001)

抑郁癥目前已成為全球性的主要精神衛(wèi)生問(wèn)題，世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，到2020年抑郁癥造成的疾病負(fù)擔(dān)將列為全球疾病總負(fù)擔(dān)第2位，僅次于冠心病，因而被稱為新世紀(jì)健康的第二殺手[1]，其病因尚未完全闡明，但生活事件(life events，LEs)，尤其是應(yīng)激性生活事件起“扳機(jī)”作用[2]。抑郁癥發(fā)病前約92%的患者有LEs，提示LEs在抑郁癥發(fā)生中起重要作用[3]。在神經(jīng)內(nèi)分泌改變上體現(xiàn)為下丘腦－垂體－腎上腺(hypothalamus pituitary ad －renal，HPA)軸的功能亢進(jìn)，在應(yīng)激引起的一系列病理生理和行為反應(yīng)中，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)起著重要作用，因此筆者選擇目前國(guó)外學(xué)者廣泛采用的慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)法相結(jié)合建立抑郁動(dòng)物模型展開(kāi)研究[4－5]，觀察針刺對(duì)下丘腦 CRF 表達(dá)的影響，深入探討針刺治療抑郁癥的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

64只3月齡清潔級(jí)健康Wister雄性大鼠，體重180～220 g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食水。然后對(duì)每只大鼠進(jìn)行開(kāi)野實(shí)驗(yàn)，剔除水平運(yùn)動(dòng)加垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)平均大于100次或少于50次的大鼠，再將64只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、鹽酸氟西汀組和頭穴叢刺組各16只，正常對(duì)照組4只/籠，其余組單籠飼養(yǎng)，末次治療后再將正常對(duì)照組、模型組、鹽酸氟西汀組和頭穴叢刺組各隨機(jī)再分為兩組，每組8只大鼠，分別進(jìn)行大鼠下丘腦CRF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)試驗(yàn)及下丘腦CRFmRNA相對(duì)含量表達(dá)試驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

－70℃冰箱;恒溫高速離心機(jī);促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子放免試劑盒;自制敞箱(長(zhǎng)80 cm、寬80 cm、高40 cm);華佗針灸針;電針治療儀。

1.4 模型制備

按照文獻(xiàn)方法[6]制備大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型。模型組、頭穴叢刺組、鹽酸氟西汀組單籠飼養(yǎng)并接受14天各種不同的應(yīng)激刺激，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。刺激包括冰水游泳、熱應(yīng)激、禁水、禁食、夾尾、電擊足底、搖晃、晝夜顛倒等刺激，每天隨機(jī)安排1種，在刺激之前給予持續(xù)10 s的鈴聲提示，正常對(duì)照組每日抓取1次，予以10 s鈴聲提示但不予刺激。

1.5 治療方法

經(jīng)14天慢性應(yīng)激刺激后，鹽酸氟西汀組給予鹽酸氟西汀1 mg/kg每日1次，連續(xù)給藥14天;頭穴叢刺組參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》選“百會(huì)”、“神庭”及“四神聰”，用華佗牌30號(hào)半寸毫針進(jìn)行針刺，向后平刺0.2 cm左右，“百會(huì)”、“神庭”針柄接電針治療儀，頻率2 Hz，電流強(qiáng)度0.6 mA左右，以大鼠頭部微顫為宜。留針20 min，每日1次，連續(xù)針刺14天。

1.6 取材及標(biāo)本制備

對(duì)各組大鼠進(jìn)行開(kāi)野實(shí)驗(yàn)后:①隨機(jī)每組取8只，將大鼠麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，開(kāi)胸暴露心臟，左心室插管高壓灌注生理鹽水，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，待肝臟變白后再用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，浸于4%多聚甲醛固定24 h，分離下丘腦，將下丘腦石蠟包埋、切片，免疫組化法檢測(cè)各組大鼠下丘腦CRF陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。②每組取另外8只，將大鼠麻醉后立即斷頭取腦，迅速分離下丘腦置勻漿器，冰浴加Trizol充分混勻后加入氯仿低溫高速離心取上清液，加入異丙醇，再次低溫高速離心，棄上清液，留取白色沉淀，經(jīng)乙醇洗滌烘干，加DEPC水溶解、55℃促溶10 min后，置－70℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?，RT－PCR法檢測(cè)下丘腦CRFmRNA表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 開(kāi)野實(shí)驗(yàn)結(jié)果

見(jiàn)表1。造模前各組大鼠的水平及垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。治療前與正常組相比，模型組、頭穴叢刺組、鹽酸氟西汀組大鼠的水平及垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05);治療后，頭穴叢刺組、鹽酸氟西汀組的水平及垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)與模型組相比明顯增加，有顯著性差異(P＜0.05)。通過(guò)觀察模型組大鼠水平及垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)逐漸減少說(shuō)明隨刺激的時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠的抑郁程度也在逐步加重，提示頭穴叢刺療法能增加抑郁模型大鼠的運(yùn)動(dòng)度及好奇度，具有防治抑郁的作用。

表1 Open－filed法測(cè)定各組大鼠水平及垂直運(yùn)動(dòng)情況(±s，次)

表1 Open－filed法測(cè)定各組大鼠水平及垂直運(yùn)動(dòng)情況(±s，次)

注:與正常組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，▲P ＜0.05;與頭穴叢刺組比較，△P＞0.05。

16 81.1 ±15.7 77.3 ±14.7 72.1 ±15.9模型組 16 79.3 ±16.3 42.3 ±12.8* 29.9 ±11.2頭穴叢刺組 16 79.6 ±15.9 44.6 ±14.5* 61.4 ±19.9▲鹽酸氟西汀組 16 82.7 ±14.8 41.0 ±15.6* 68.2 ±14.3造模前 治療前 治療后正常組組別 n▲△

2.2 下丘腦CRF的表達(dá)

見(jiàn)表2。模型組與正常組比較，大鼠下丘腦CRF陽(yáng)性細(xì)胞比及下丘腦CRFmRNA相對(duì)含量表達(dá)模型組明顯高于正常組(P＜0.05)，頭穴叢刺治療可明顯降低抑郁模型大鼠下丘腦內(nèi)的CRF表達(dá)(P＜0.05)，療效與鹽酸氟西汀組類似(P＞0.05)。

表2 各組大鼠下丘腦CRF陽(yáng)性細(xì)胞比及下丘腦CRFmRNA相對(duì)含量表達(dá)

3 討論

抑郁癥的病因至今尚未徹底闡明，目前認(rèn)為，長(zhǎng)期慢性、低水平的應(yīng)激源是促進(jìn)抑郁發(fā)生、發(fā)展的主要原因。慢性不可預(yù)知性大鼠應(yīng)激模型就是根據(jù)此理論建立的，這一模型已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者探討抑郁癥發(fā)病機(jī)制和抗抑郁藥作用機(jī)制而廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型。前期實(shí)驗(yàn)證明頭穴叢刺法可以明顯改善慢性抑郁模型大鼠的行為學(xué)改變[6]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，并且與陽(yáng)性對(duì)照組鹽酸氟西汀組比較，開(kāi)野實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)明顯差別，提示頭穴叢刺在提高模型大鼠活動(dòng)度與求知度方面可達(dá)到與西藥鹽酸氟西汀類似效果。

應(yīng)激是機(jī)體對(duì)外界傷害性環(huán)境變化的反應(yīng)，短時(shí)間應(yīng)激反應(yīng)可使機(jī)體渡過(guò)難關(guān)、危險(xiǎn)以適應(yīng)環(huán)境變化，但長(zhǎng)時(shí)間過(guò)度應(yīng)激刺激會(huì)造成機(jī)體功能紊亂，出現(xiàn)對(duì)周圍事物的興趣降低、食欲減退、生存欲望低、學(xué)習(xí)記憶能力下降等癥狀，CRF作為一種應(yīng)激激素和腦發(fā)育中關(guān)鍵的神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要刺激垂體前葉釋放促腎上腺皮質(zhì)激素。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn)，CRF釋放增加，腎上腺皮質(zhì)激素分泌增加，機(jī)體可出現(xiàn)抑郁癥狀[7]。CRF神經(jīng)元主要位于下丘腦，本研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激模型大鼠下丘腦內(nèi)CRF陽(yáng)性細(xì)胞比及下丘腦CRFmRNA相對(duì)含量表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯升高，證明長(zhǎng)期慢性應(yīng)激刺激可造成大鼠腦內(nèi)CRF表達(dá)增加同時(shí)伴隨行為學(xué)改變，并且與行為學(xué)改變正向相關(guān)，頭穴叢刺可以明顯降低大鼠腦內(nèi)CRF的表達(dá)，并糾正大鼠行為學(xué)的改變，效果接近陽(yáng)性對(duì)照組鹽酸氟西汀組。證明頭穴叢刺抗抑郁作用可能與干預(yù)調(diào)整因長(zhǎng)期慢性應(yīng)激刺激造成的CRF增高有關(guān)，為今后針刺抗抑郁機(jī)理研究提供依據(jù)。

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