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    熒光光譜研究多種印染助劑對活性深藍M-2GE結合絲素肽的影響*

    2013-11-24 08:35:10馬明明楊家彪蘇新科
    關鍵詞:絲素常數(shù)染料

    馬明明,楊家彪,蘇新科

    (西安工程大學環(huán)境與化工學院,陜西西安 710048)

    絲素肽 (SP)是絲素蛋白水解后的大分子多肽物質,含有18種氨基酸,生物相容性優(yōu)異[1],作為添加劑可以改善產品的性能,在印染工業(yè)、食品、化妝品、醫(yī)藥等[2-3]等領域有較多應用。特別是添加到印染體系后,可以顯著提高織物的染色指標[4-5]。然而,并沒有絲素肽與染色織物的染料小分子結合機理的相關文獻報道。因此開展染料小分子結合絲素肽的工作就十分必要。

    活性深藍M-2GE(RDBMG)是雙偶氮熒光鈉鹽染料,適用于滌棉、滌黏染色[6],化學結構式如圖1所示。熒光光譜法簡單,靈敏,依據(jù)熒光峰位或強度的變化可迅速判斷兩組分是否有相互作用,進一步推算出二者的結合機制。本文應用熒光光譜法研究了活性深藍M-2GE對絲素肽在305nm處熒光的猝滅,探討了猝滅機理,紫外可見、同步熒光光譜也進一步證實了這一結果。印染工藝中常見物質紡織淀粉、氨基酸、離子液體、氧化劑、表面活性劑、金屬離子對二者結合體系有不同的影響,為今后絲素肽在活性深藍M-2GE印染體系中的工藝條件選擇提供了依據(jù)。

    圖1 RDBMG的化學結構式Fig.1 The chemical structural formula of RDBMG

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    熒光分光光度計 (RF-5301PC,日本島津);紫外可見分光光度計 (UV-2450,日本島津);三用恒溫水浴箱 (H-60,國華化學儀器);1×10-4mol/L、1 ×10-3mol/L 活性深藍 M-2GE(江蘇申新),儲備液;1.0 g/L絲素肽 (浙江絲綢科技研究有限公司)儲備液;溴化-1-己基-2,3-二甲基咪唑 (上海成捷化學有限公司);1-乙基-2,3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽 (上海成捷化學有限公司);氯化羥乙基三甲基胺 (上海成捷化學有限公司);磷酸氫二鈉 (天津市登峰化學試劑廠);磷酸二氫鈉 (天津市博迪化工有限公司);原淀粉、聚丙烯醛胺、醛酸酯淀粉、氧化淀粉和磷酸酯淀粉漿料 (西安工程大學紡織材料學院);L-組氨酸、L-天冬氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨基酸、L-白氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸 (國藥集團化學試劑有限公司),試劑均為分析純,實驗用水為原子級水。

    1.2 實驗方法

    在一系列25 mL比色管中,分別加入0.26 g/L絲素肽、2 mL B.R.(pH 6.37)緩沖溶液和一定量體積的1×10-4mol/L活性深藍M-2GE,用水稀釋至刻度,搖勻,室溫下靜置10 min;將待測溶液倒入石英比色皿,置于樣品室,發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為5 nm,在熒光光度計上記錄熒光發(fā)射光譜。在熒光猝滅實驗中,激發(fā)波長選擇275 nm,掃描范圍為280~400 nm,在305 nm峰位記錄熒光強度。同步熒光光譜測定中Δλ=15 nm(其中λem=280 nm,λex=265 nm)和 Δλ =60 nm(λem=280nm,λex=220 nm),Δλ =λem-λex,并在紫外可見分光光度計上掃描 (220~800 nm)吸收光譜;同步熒光掃描中λem=λex=275 nm。

    2 結果與討論

    2.1 RDBMG與SP作用機制

    2.1.1 RDBMG與SP相互作用的熒光光譜特征

    采用單因子輪換法,對RDBMG猝滅SP熒光強度的條件如SP濃度、結合時間、緩沖溶液種類及其pH等進行了優(yōu)化。結果顯示,當SP濃度為0.26 g/L,作用時間為10 min,B.R.緩沖溶液 pH為6.37時,RDBMG對SP熒光強度猝滅條件最佳。在最佳實驗條件下,研究了RDBMG猝滅SP熒光強度原理。圖2是295 K在不同濃度RDBMG存在下,SP熒光強度F與RDBMG濃度 ([Q])的F0/F~[Q]關系圖。由圖可見,隨著RDBMG濃度的增加,F(xiàn)0/F 不斷增大,在 1.0×10-6~2.0×10-5mol/L范圍內,F(xiàn)0/F與 [Q]并不是全呈線性關系;當 RDBMG濃度大于1.4×10-6mol/L時,曲線向上彎曲,說明SP與RDBMG作用后,使SP的內源熒光發(fā)生猝滅。猝滅有靜態(tài)、動態(tài)猝滅或二者兼而有之。對動態(tài)猝滅,遵循 Stern-Volmer[7]等式:F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q],F(xiàn)0、F分別是SP在加入猝滅劑 (RDBMG)前后的熒光強度,Kq是生物大分子的熒光猝滅速率常數(shù),τ0是無猝滅劑時SP的平均壽命,KSV是動力學猝滅常數(shù),[Q]是猝滅劑的濃度。τ0取10-8s。計算出不同溫度下的Kq均大于生物大分子的限制擴散系數(shù) 2 ×1010L·mol-1·s-1[8-9],說明 RDBMG 引發(fā)SP猝滅不是動力學碰撞,而是二者結合為配合物后使其熒光猝滅。對靜態(tài)猝滅,符合等式:lg [(F0-F)/F]=lg K+nlg [Q][8],其中 KA是猝滅劑與生物大分子的結合常數(shù),n是猝滅劑與每個生物大分子的結合點數(shù),[Q]是猝滅劑濃度。研究發(fā)現(xiàn)在295~318 K的溫度范圍內,隨溫度增加,RDBMG與SP結合常數(shù)出現(xiàn)先逐漸減小后增大,但結合位點數(shù)基本不變,大約為1。

    圖2 295 K溫度下RDBMG+SP結合體系熒光光譜曲線及Stern-Volmer曲線Fig.2 The fluorescence spectrum of SP+RDBMG at 295K and Stern-Volmer plot

    根據(jù) F?rster非輻射能量轉移理論[10],能量轉移效應不僅與給體與受體之間的距離有關,還與臨界轉移距離R0有關。其中,能量轉移效率E與R0之間存在下列等式:E=,E=1 -F/F0=8.8 × 10-25Κ2Ν-4Φ J,r為熒光給體與受體結合距離,K2為偶極子空間定向因子,N為介質的折射指數(shù),Φ為熒光給體熒光量子產率,J為給體熒光光譜和受體紫外-可見吸收光譜的重疊積分。光譜重疊積分符合下列關系

    F(λ)是給體在波長λ處的熒光強度,ε(λ)是受體在波長 (處的摩爾吸收系數(shù)。圖3是SP熒光發(fā)射光譜 (1)和RDBMG(2)紫外可見光譜重疊圖,在圖中通過OriginPro7.5軟件計算J=3.46×10-14cm3·L·mol-1。已知 K2=2/3,N=1.336,Φ =0.15[11],算得 R0=3.14 nm,實驗數(shù)據(jù) IF=414.232,=918.35 ,得 E=0.55 代入 (1)式,r=3.04 nm。SP與 RDBMG 作用距離 r=3.04 nm,小于7 nm,符合非輻射能量轉移條件,說明能量由SP轉移給RDBMG的概率非常大,因此RDBMG對SP的的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

    圖3 SP熒光光譜 (1)和RDBMG紫外吸收光譜 (2)的重疊圖ig.3 The overlay of the fluorescence emission spectrum of SP(1)and the absorption spectrum of RDBMG(2)

    2.1.2 RDBMG與SP相互作用的紫外光譜 由于動態(tài)猝滅是猝滅劑與激發(fā)態(tài)分子碰撞作用,對吸收光譜無影響,而靜態(tài)猝滅是與基態(tài)分子作用,形成締合物,會引起吸收光譜的改變??疾炝薙P+RDBMG體系的紫外吸收光譜。圖4是1×10-5mol/L RDBMG和0.26 g/L SP以及兩者混合時的紫外吸收光譜。

    圖4 RDBMG與SP的紫外光譜圖Fig.4 The absorption spectrum of RDBMG and SP

    由圖4知,SP在275 nm處有一吸光度比較小,RDBMG在295 nm處有一峰,兩者混合后,0.18 g/L SP在275 nm處的峰完全消失,當加大SP濃度到0.50 g/L時,由于SP過量造成,在275 nm又出現(xiàn)SP峰 (圖中曲線5);同時SP在205 nm處峰紅移至218 nm處,以上可說明二者發(fā)生反應。

    2.1.3 同步熒光光譜 同步熒光光譜通??梢蕴骄康鞍踪|構象的變化。當Δλ=15 nm時,同步熒光光譜顯示蛋白質酪氨酸殘基的熒光;若Δλ=60 nm,則為蛋白質色氨酸殘基的熒光。由于蛋白質中酪氨酸、色氨酸殘基的最大熒光發(fā)射波長與其所處的環(huán)境的極性有關,因此,根據(jù)最大熒光發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質構象的變化。

    圖5為RDBMG與SP相互作用的同步熒光光譜圖。由圖5(A)知,RDBMG的加入使SP酪氨酸殘基在最大發(fā)射波長處的熒光強度逐漸減小;由圖5(B)可以看出SP色氨酸殘基在最大發(fā)射波長處的熒光強度由于RDBMG的存在而逐漸減弱,290 nm處峰位沒有移動,但327 nm處峰位出現(xiàn)紅移,因此RDBMG與SP結合改變了酪氨酸、色氨酸殘基所處的環(huán)境。

    圖5 RDBMG+SP體系的同步熒光譜圖Fig.5 The sychronous fluorescence spectra of RDBMG+SP

    2.2 印染工藝中常用物質對RDBMG結合SP的影響

    2.2.1 表面活性劑對RDBMG結合SP的影響 表面活性劑可以改善染料的溶解度和染色性能,提高勻染性、上染速率和染色牢度[11-12]。當結合體系中存在曲拉通X-100、十二烷基苯磺酸鈉、CTAB等表面活性劑時,結合常數(shù)由3.37×105分別變?yōu)?.56×106、1.85 ×106和 3.55 ×106。可見,無論是哪種類型的表面活性劑,均能使結合體系結合常數(shù)增加,且增加倍數(shù)超過5倍。這與表面活性劑在體系中形成膠束,增強RDBMG溶解度,使RDBMG小分子更易于進入SP肽鏈結構有關。

    2.2.2 常用氧化劑對結合體系的影響 染色工藝中,染料隱色體以鈉鹽形式存在,在染色后需要在氧化劑作用下生成不溶性的染料,恢復染料原來的顏色,在此過程中,選擇氧化劑的種類和用量非常重要,均對染色深淺和色光影響較大,氧化不足造成色淺,氧化過度染色加深,色光暗。試驗了K2S2O8、K2Cr2O7、H2O2三種氧化劑對結合參數(shù)的影響。結果顯示三種氧化劑的存在并沒顯著改變結合位點,但使結合常數(shù)變小,即由原來的結合常數(shù)3.37 ×105分別變?yōu)?0.15 ×105、2.04 ×105、2.89×105;且氧化劑氧化性越強,結合常數(shù)減小越明顯。這主要是由于氧化劑可氧化肽鏈氨基酸殘基[13],破壞發(fā)色基,將發(fā)色基變?yōu)榭山到饨Y構,從而使染料與絲素肽的結合力下降造成的。

    2.2.3 金屬離子對結合體系的影響 金屬離子在紡織領域主要表現(xiàn)在染色、對絲素蛋白的作用、真絲的改性和防脆化處理以及抗菌、消臭、助燃、導電和防電磁波輻射等作用上[14]。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)金屬離子是通過形成空雜化軌道以接受纖維或織物上氨基、羧基、羥基、氰基等極性基團的孤對電子,通過配位鍵形成絡合物。其中,在與蛋白質纖維絡合時,一個中心金屬離子還可以與多個氨基酸形成環(huán)狀絡合物,且絡合物形成的環(huán)數(shù)愈多配位愈多,絡合鹽的穩(wěn)定性愈好。Ca2+、Zn2+、Ba2+、Cu2+四種離子分別存在時對結合常數(shù)有不同的影響。除了Cu2+使結合常數(shù)變小外,其他三種離子都使其增大。Ca2+、Zn2+、Ba2+與SP存在螯合作用,誘導SP的結構由無規(guī)則的SilkⅠ向 β-折疊構象轉變[15],形成相對穩(wěn)定的環(huán)境,增強RDBMG與SP的結合,但Cu2+還可以與 RDBMG上的-形成鍵能較大的化學鍵,封閉了染料的水溶性基團,導致RDBMG與SP結合減弱,結合常數(shù)會減小。

    2.2.4 離子液體對結合體系的影響 離子液體作為良好的溶劑,常用作染料的分散劑,蠶絲、纖維素和羊毛的再生紡絲溶劑,苧麻和羊毛纖維的改性試劑以及用于染色廢水處理[16]等。試驗了三種離子液體溴化-1-己基-2,3-二甲基咪唑、1-乙基-2,3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺、氯化羥乙基三甲基胺對結合體系的影響,結果見表1。離子液體的存在大幅增加結合常數(shù),說明具有優(yōu)良溶解性能的離子液體增強SP和RDBMG親水結合環(huán)境,使SP和RDBMG更易結合。

    表1 室溫下離子液體存在下SP-RDBMG體系的靜態(tài)猝滅方程Table 1 Static quenching equation of SP-RDBMG – ionic liquids system at room temperature

    2.2.5 紡織漿料對結合體系的影響 紡織漿料是使紗條表面光滑、耐磨、柔韌且有一定強度的漿膜??梢允辜啑l表面的纏繞纖維緊貼紗條的主干,降低紗條表面的摩擦系數(shù),同時使部分漿液滲入紗線內部,增加纖維之間的黏付力,提高紗線的抗拉強度,以適應織造過程中的大張力、中打緯,減少斷頭提高效率。常見漿料以淀粉為主要原料。本文試驗了幾種不同結構的漿料對結合體系靜態(tài)猝滅方程的影響。聚丙烯醛胺和醋酸酯淀粉結構復雜,空間位阻較大,在結合體系存在時會阻礙SP與RDBMG結合,導致結合常數(shù)下降。而原淀粉、磷酸酯淀粉、氧化淀粉結構相對簡單,官能團之間交聯(lián)程度小,能促進SP表面活性位點增多,有利于RDBMG的結合,因此這三種淀粉存在時結合體系結合常數(shù)增加。

    2.2.6 氨基酸對結合體系的影響 氨基酸是兩性物質,含有—COOH和—NH2,在染色體系中能改善染料染色性能。本文試驗了11種不同氨基酸對SP結合RDBMG的影響。L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸和甘氨酸能夠降低SP與RDBMG的結合常數(shù);而L-天冬氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨基酸、L-白氨酸、L-脯氨酸則使二者結合常數(shù)增大,其中L-白氨酸使結合常數(shù)增加最大,比最初的結合常數(shù)高約30倍。這與氨基酸的性能密切相關。L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸和甘氨酸的親水性差,導致RDBMG不易和SP結合;而其余幾種氨基酸親水性較好,有利于SP結合RDBMG,因此能提高結合常數(shù)。

    3 結論

    1)RDBMG與SP結合形成作用距離為3.04 nm、結合為1∶1的復合物后,以靜態(tài)猝滅方式猝滅SP內源熒光,從而改變了酪氨酸、色氨酸殘基所處的環(huán)境,引起SP肽鏈構象結構縮聚變化。

    2)表面活性劑、鹽類、氧化劑、離子液體、氨基酸和漿料能改善絲素的染色性能。實驗表明三種表面活性劑CTAB、十二烷基苯磺酸鈉、曲拉通X-100有利于RDBMG與SP結合作用;雙氧水、K2S2O8和K2Cr2O7三種氧化劑對二者結合都不利,氧化性越強影響程度越大;CaCl2、Zn(NO3)2和BaCl2三種鹽都能使結合體系結合常數(shù)變大,由于Cu(NO3)2·3H2O能與RDBMG螯合導致結合常數(shù)變小;離子液體溴化1-乙基-2,3-二甲基咪唑、1-乙基-2,3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽、氯化羥乙基三甲基胺三種離子液體都較大程度增大了結合常數(shù),在染色過程中可考慮加入此類離子液體;原淀粉、磷酸酯淀粉、氧化淀粉都有利于RDBMG與SP結合,其中氧化淀粉對二者結合最有利,聚丙烯醛胺和醛酸酯淀粉漿料會減弱SP和活性深藍M-2GE的結合。11種氨基酸中,只有 L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸和甘氨酸使RDBMG與SP結合常數(shù)變小,因此體系中不宜含有這四種氨基酸。

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