擱板溫度對人血小板凍干保存的影響

王 波， 周 正， 徐夢潔， 許先國， 張紹志， 陳光明

（1.解放軍第117醫(yī)院 危重病醫(yī)學科，杭州 310013；2.浙江大學 能源工程學系，杭州 310027；3.浙江省血液中心 輸血研究所，杭州 310006）

血小板輸注在臨床治療上有重要應(yīng)用，然而，現(xiàn)有的血小板保存方法都存在很大的局限性，冷凍干燥將為血小板的長期保存提供一種較為理想的方法，相關(guān)研究近年來在國內(nèi)外都得到了重視.影響凍干血小板復(fù)水后恢復(fù)率和功能的因素有很多，如保護劑 種 類 和 濃 度［1－3］、凍 結(jié) 速 率［4］、復(fù) 水 條 件［5］等.凍干過程的其它工藝參數(shù)，如溫度、壓力和干燥持續(xù)時間，可能對血小板凍干的效果也有影響，但目前研究還很少.其中，一次干燥溫度是一個十分重要的參數(shù)，該溫度過高可能導(dǎo)致物料出現(xiàn)塌陷.但一次干燥溫度也不能過低，有文獻指出，該溫度每降低1 ℃，升華干燥時間將增加13%［6］.干燥時間的延長，不僅影響生產(chǎn)效率，而且可能影響凍干效果.本文作者曾在－38～－40 ℃的擱板溫度下進行過1mL 血小板懸浮液的凍干，效果較好，但由于一次干燥溫度位低，干燥持續(xù)時間長達16～18h.如果增加血小板的容量，或加厚凍干瓶內(nèi)裝液的高度，持續(xù)時間會更長.為了縮短一次干燥時間，本文將嘗試采用比－38 ℃高的擱板溫度進行血小板的一次干燥，根據(jù)凍干血小板復(fù)水后的數(shù)值恢復(fù)率、凋亡及活化情況，來尋找更加合適的一次干燥參數(shù).

1 材料和方法

1.1 血小板洗滌

新鮮濃縮血小板（1.0×109～1.5×109血小板／mL）來自健康無償獻血者，由浙江省血液中心提供.將富含血小板的血漿離心15 min，使血小板沉淀并去除上層血漿；而后加適量生理鹽水，將血小板打散使之懸浮；之后再離心10min，收集血小板，重復(fù)此操作兩次.

1.2 海藻糖載入血小板

用 含 有 50 mmol／L 海 藻 糖 的 緩 沖 液（100mmol／L NaCl、10mmol／L KCl和10mmol／L EGTA）將洗滌后的血小板重懸，制成濃度約為1×109個／mL 的孵化懸浮液；將上述處理后的血小板孵化懸浮液置于37℃的恒溫震蕩水浴中孵化，震蕩頻率為40次／min，得到的血小板內(nèi)海藻糖濃度達到約13mmol／L［7］.

1.3 血小板的冷凍干燥

凍干保護液的基準緩沖液（PBS 緩沖液）由9.5mmol／L HEPES、 142.5mmol／L NaCl、4.8mmol／L KCl及1mmol／L MgCl2組成.以上述凍干緩沖液作為基準液，加入1%牛血清白蛋白（BSA，上海生工）作為塑性劑，加入20%海藻糖（C10H22O11·2H2O，北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司）作為細胞外保護劑，濃度百分比以w／v（g／100mL）表示，配置成血小板凍干保護液.將已載入海藻糖的血小板洗滌后重懸于該凍干保護液中，調(diào)整細胞懸浮液濃度為1×109個／mL左右.

取1mL血小板凍干懸浮液裝入直徑為25mm的玻璃瓶中，放入－60 ℃低溫冰箱中進行預(yù)凍，其冷卻速率約為10 ℃／min［8］.維持2h之后，迅速取出凍結(jié)的血小板樣品，置于預(yù)先冷卻至一次干燥溫度的FreeZone12plus型凍干機（LabConco，美國）凍干箱內(nèi)隔板上，進入預(yù)先設(shè)定好的程序，一次干燥時間為20h.一次干燥結(jié)束后以0.2 ℃／min的加熱速率使擱板溫度升至二次干燥溫度20℃，二次干燥時間為10h.一次干燥參數(shù)見表1.

表1 血小板一次干燥溫度參數(shù)Tab.1 Primary drying temperatures of platelet lyophilization ℃

1.4 凍干血小板復(fù)水

將PBS緩沖液和蒸餾水以3：1 比例混合制成血小板凍干復(fù)水液，將1 mL 的復(fù)水液在室溫下直接加入凍干樣品瓶中，輕輕震蕩，樣品迅速完全溶解于復(fù)水溶液中.

1.5 凍干復(fù)水血小板血液學分析

用CELL－DYN1700型血球計數(shù)儀（Abbott，美國）分別對凍干前的血小板和凍干復(fù)水后的血小板計數(shù)，血小板凍干保存的數(shù)值恢復(fù)率（RP）的計算公式為

式中，Na表示凍干復(fù)水后的血小板計數(shù)；Nb表示凍干前的血小板計數(shù).

利用血球計數(shù)儀測定復(fù)水后的血小板平均體積（MPV）以及分布寬度（PDW），得到PDW 曲線.

1.6 凍干復(fù)水血小板活化的三色流式分析

1.6.1 凍干復(fù)水血小板凋亡檢測

本實驗以1mL新鮮富含血小板血漿（PRP）為陰性對照，1mL凍干后的血小板為實驗樣品，采用流式細胞儀FACSCalibur（BD，美國）進行檢測，步驟如下：

a.樣本制備.實驗組和對照組的血小板懸液樣品離心3min（1 500轉(zhuǎn)／min），用0.5mL 結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）重懸.

b.熒光染色.取10μL該溶液加入流式專用管（BD，美國），再依次向管中加入10μL PI染色劑和5μL Annexin V－FITC試劑，添加試劑后的BD 管室溫避光15 min進行染色.

c.避光染色后的BD 管中加入500μL生理鹽水稀釋，1 h之內(nèi)上機檢測.

d.數(shù)據(jù)結(jié)果使用CellQuest軟件進行分析.

1.6.2 凍干復(fù)水血小板活化檢測

本實驗以1mL新鮮富含血小板血漿（PRP）為陰性對照，1 mL 核苷酸（ADP）處理后的活化血小板為陽性對照，1mL 凍干后的血小板為實驗樣品，采用流式細胞儀進行檢測，步驟如下：

a.樣本制備.實驗組和對照組的血小板懸液樣品離心3min（1 500轉(zhuǎn)／min），用0.5mL 結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）重懸.

b.熒光染色.取10μL 該溶液加入流式專用管，再依次向管中加入7.5μL CD62p－PE和PAC－1 FITC，添加試劑后的BD 管室溫避光15 min 進行染色.

c.避光染色后的BD 管中加入500μL生理鹽水稀釋，1 h之內(nèi)上機檢測.

d.數(shù)據(jù)結(jié)果使用CellQuest軟件進行分析.

1.7 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果以5次獨立實驗的平均值±標準差表示，組間統(tǒng)計顯著性差異P 用異方差假設(shè)t檢驗進行比較.

2 結(jié) 果

2.1 一次干燥溫度位對血小板數(shù)值恢復(fù)率的影響

將密封保存于室溫下的凍干血小板復(fù)水，7 種不同溫度位下的血小板凍干復(fù)水后的數(shù)值恢復(fù)率分別為（60.4±8.0）%a，b，（80.8±3.9）%b，c，（84.1±4.4）%c，d，（89.0±3.2）%a，d，e，（89.5±2.1）%，（89.6±1.6）%，（89.9±1.4）%e，如圖1所示.（注：a：P＝0.000；b：P＝0.001；c：P＝0.233；d：P＝0.365；e：P＝0.572）

結(jié)果表明，凍干復(fù)水后的血小板數(shù)值恢復(fù)率隨著溫度的降低而增加，到達－30 ℃時基本不變，達到89%左右.隨著干燥溫度的上升，凍干復(fù)水后血小板恢復(fù)率迅速下降，達到－20 ℃時下降至61%.

2.2 一次干燥溫度位對血小板形態(tài)分布的影響

表2表示血小板的MPV和PDW 值隨一次干燥溫度的變化關(guān)系.

圖1 凍干復(fù)水后血小板的數(shù)值恢復(fù)率（n＝5）Fig.1 Numerical recovery rate of platelets after freezedrying and rehydration（n＝5）

表2 凍干前后血小板的MPV 和PDW（n＝5）Tab.2 MPV and PDW of platelets before and after lyophilization（n＝5）

實驗結(jié)果表明，不論一次干燥溫度的取值為多少，血小板凍干復(fù)水后的MPV 和PDW 值均較復(fù)水前偏大，一部分實驗組的值甚至超過了人體血小板的正常標準參考值，說明血小板凍干和復(fù)水過程對其形態(tài)和體積分布影響較大.

2.3 凍干血小板凋亡標志物的表達

使用流式細胞儀對－30℃作為一次干燥溫度的凍干血小板進行凋亡檢測，檢測結(jié)果用CellQuest軟件進行分析，結(jié)果如圖2（見下頁）所示.首先根據(jù)血小板大小和顆粒性在前向角／測向角散射光（FSC／SSC）中設(shè)門R2（圖2（a）中橫坐標和縱坐標分別代表前向角與測向角散射光信號強度）.由于CD61能與血小板細胞特異性結(jié)合，對R2區(qū)域中的細胞，在圖2（b）中標志CD61－PerCP為陽性的細胞設(shè)門R1（圖2（b）中橫坐標表示PerCP 熒光信號強度），區(qū)分血小板細胞和其它碎片及污染物，對R1區(qū)域中的血小板進行凋亡和活化分析.

圖2 流式細胞術(shù)（FCM）檢測凍干復(fù)水后的血小板凋亡率Fig.2 Apoptosis rate of platelets detected by FCM

AnnexinV－FITC能與細胞膜上凋亡早期的標志物磷脂酰絲氨酸結(jié)合呈陽性，PI染色劑能進入細胞膜被破壞的細胞中，與染色體結(jié)合呈陽性.根據(jù)新鮮血小板將圖2（c）分為4個象限，左下象限為非活化的存活血小板，右下象限為早期凋亡的血小板，左上和右上象限PI染色呈陽性，表示晚期凋亡或死亡的血小板.圖2（c），（d）中橫坐標與縱坐標分別表示FITC與PI熒光信號強度.

結(jié)果表明，實驗組和對照組的活細胞數(shù)均占血小板總數(shù)的85%以上，但是凍干復(fù)水后血小板的細胞凋亡率顯著高于新鮮血小板的自然凋亡率.詳細數(shù)據(jù)參見表3.

表3 Annexin V／PI熒光標記法檢測血小板的凋亡（n＝5）Tab.3 Apoptosis rate of rehydrated platelets detected by Annexin V／PI fluorescent mark method（n＝5）

2.4 凍干血小板活化標志物的表達

PAC－1－FITC和CD62P－PE分別為血小板表面活化早期標志物和活化晚期的標志物.根據(jù)新鮮血小板陰性對照同樣將圖3（a）分為4個象限，左下象限為非活化血小板，右下象限為活化早期血小板，右上象限為活化晚期血小板.利用流式細胞術(shù)（FCM）檢測血小板 活 化 標 志 物PAC－1 和CD62p 的 表 達，圖3 為CellQuest分析結(jié)果，圖中橫坐標和縱坐標分別表示FITC和PE熒光信號強度.最終詳細數(shù)據(jù)參見表4.

表4 PAC－1／CD62p熒光標記法檢測血小板的活化（n＝5）Tab.4 Activation rate of rehydrated platelets detected by PAC－1／CD62p fluorescent mark method（n＝5）

圖3 FCM 檢測凍干復(fù)水后的血小板活化率Fig.3 Activation of rate platelets detected by FCM

3 討 論

冷凍干燥法保存血小板可以大大延長血小板的保存期限，并且具有輕便易帶、復(fù)水后可以直接使用等優(yōu)點，近年來成為血小板保存技術(shù)研究的熱點［9］.目前國內(nèi)關(guān)于血小板冷凍干燥保存的研究主要是針對保護劑配方優(yōu)化而進行的.周新麗等研究了海藻糖作為細胞內(nèi)外保護劑的凍干配方問題［7］.曹偉等研究了乙醛前處理和海藻糖載入血小板的問題［10］，劉景漢等研究了海藻糖加載技術(shù)和測定方法［8］.優(yōu)化凍干參數(shù)方面的研究目前仍很少，雖然已有學者對冷凍速率、退火等預(yù)凍過程中的操作參數(shù)進行了一定的研究，但是對于干燥過程的參數(shù)幾乎無涉及，尤其是一次干燥溫度的選取.在食品、藥品和微生物冷凍干燥領(lǐng)域，有學者認為物料的溫度在整個凍干過程必須始終低于其部分玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg’［11－12］，也就是說一次干燥的溫度必須低于Tg’.另有學者認為，結(jié)晶型系統(tǒng)的一次干燥溫度要低于物料的共晶溫度Te，無定形系統(tǒng)的一次干燥溫度要低于物料的Tg’［13－16］.對于無定形系統(tǒng)，Tang 等還提供了另外一種觀點，他們根據(jù)一種蛋白質(zhì)的凍干試驗結(jié)果，指出一次干燥溫度高于Tg’也是可行的［17］.

血小板凍干樣品的臨界溫度與許多因素相關(guān)，包括預(yù)凍的進程、保護劑種類和濃度等.因此，可以通過實驗的方法選擇合適的一次干燥溫度，一方面提高血小板凍干復(fù)水后的恢復(fù)率和功能，另一方面加快干燥過程的進程.

由上述實驗結(jié)果可以看出，經(jīng)過預(yù)凍的血小板保存液在－30℃左右的數(shù)值恢復(fù)率達到較滿意的水平（＞85%），即使溫度下降到－40 ℃，恢復(fù)率提高的也并不多，但是相應(yīng)的水蒸氣升華驅(qū)動力卻從12.9Pa提高到了38.0Pa［13］，大大加快了干燥進程.雖然凍干血小板保存液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為－34.3 ℃，但是經(jīng)過凍結(jié)形成的血小板并不是完全的無定形系統(tǒng)，干燥過程中的臨界溫度也不再是其相應(yīng)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度了.實驗結(jié)果表明，略微提高干燥溫度，并不會對樣品的存活率產(chǎn)生很大的影響.但是，當溫度上升到－25 ℃甚至－20 ℃時，會對血小板凍干后的存活率產(chǎn)生極大的影響，存活率明顯下降，這說明溫度高到已使凍結(jié)樣品產(chǎn)生了融化現(xiàn)象.

對于一次干燥溫度為－30 ℃以下的實驗組，測得的凍干后血小板MPV 值都在正常參考范圍內(nèi).但是－30 ℃和－32 ℃組比較接近正常范圍的上限，血小板的體積在凍干后有明顯的變大趨勢.當干燥溫度高于－30 ℃后，凍干后血小板的MPV 值則均偏離了正常范圍，比12.5fL 的上限要大出許多.針對血小板分布寬度PDW，只有－40℃實驗組的凍干后血小板在正常的15.5～18.1fL范圍內(nèi)，但是也比較接近正常范圍的上限18.1fL，這說明凍干后血小板體積變異較明顯，雖然其數(shù)值恢復(fù)率達到了90%左右，但是血小板細胞由于凍干而產(chǎn)生了明顯的腫脹現(xiàn)象，血小板的功能可能會出現(xiàn)一定的損失.

經(jīng)過凍干后的血小板絕大部分集中于Annexin V 陰性和PI陰性區(qū)，說明絕大多數(shù)的細胞仍然為活細胞，且結(jié)果與之前使用血球計數(shù)儀得到的結(jié)果相差不大（89.0%）.早期凋亡的細胞約占所有血小板細胞的7.8%，說明凍干和復(fù)水過程對血小板存在影響，使得存在于細胞膜磷脂雙分子層中的PS外翻暴露于細胞膜外層，細胞進入凋亡早期階段.PI陽性的血小板細胞占總數(shù)的4.7%，這說明部分血小板的細胞膜已經(jīng)破裂，這些血小板在復(fù)水后將完全失去其原有的功能.但是，總體而言，－30 ℃作為一次干燥溫度，細胞的凋亡率比較低，仍在臨床檢驗可接受范圍之內(nèi).

－30 ℃凍干后的血小板復(fù)水后非活化率可以達到80%左右，說明約有20%的凍干后血小板失去了活性.熒光標記的CD62p（這里使用PE 作為熒光素）抗體陽性表達的血小板百分率可反映血小板活化程度［18］.有人研究發(fā)現(xiàn)，保存血小板CD62p陽性率與血小板體內(nèi)存活率及存活期呈負相關(guān)［19］.這表明，－30 ℃作為一次干燥溫度保存的血小板雖然數(shù)值恢復(fù)率較高，達到了89%，但是，輸注后的止血效果和存活時間可能會受到影響.劉景漢等人認為，CD62p的表達率較高，血小板在輸注入體內(nèi)后，不能很好地滿足提高外周血血小板數(shù)目的臨床需求，但仍然具有較好的聚集活性和促凝血活性，可以作為臨時血小板代替品進行輸注［8］.他們認為，加入適量的可逆性血小板功能抑制劑可以有效地抑制血小板的體外活化，并且抑制作用是可逆的，保證了在輸入體內(nèi)后具有原有的黏附、釋放、聚集等功能，并且具有一定的存活時間［20］.

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