犬源性奇異變形桿菌的毒力試驗

楊巧玲，高 健，羅立平，韓 博

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193）

奇異變形桿菌是廣泛分布于自然界和人及動物體表的1種機會致病菌［1］。在人醫(yī)上，它是繼大腸桿菌之后最易引發(fā)泌尿道感染的細菌，可對上泌尿道引起嚴重的組織學(xué)損傷并且常常與膀胱和腎臟結(jié)石的形成有關(guān)［2］。同時，大量的報道顯示，奇異變形桿菌還是引發(fā)嬰幼兒急、慢性腹瀉和成人慢性腹瀉的1種重要病原菌［3－4］。然而，目前對奇異變形桿菌引發(fā)的動物腹瀉報道較少［5－6］。Gaastra等于1996年從腹瀉犬的糞便中分離到了奇異變形桿菌［7］。目前已存在大量的關(guān)于奇異變形桿菌潛在毒力因子的報道，主要包括菌毛、“霧蔓”遷徙能力、尿素酶、金屬蛋白酶及溶血素等［8］。在感染的過程中，奇異變形桿菌會根據(jù)不同的情況表達不同的菌毛，主要有耐甘露糖樣變形桿菌菌毛（MRP）、奇異變形桿菌菌毛（PMF）和非凝集菌毛（UCA），并且已經(jīng)證明，在泌尿道感染疾病中起著粘附尿道上皮的作用［9－10］。金屬蛋白酶的主要功能亞單位由zapA基因編碼［11］。尿素酶主要功能亞單位由ureC基因編碼［12］。另外，溶血素的產(chǎn)生也對尿道上皮細胞具有細胞毒性［13］。此外，奇異變形桿菌還表現(xiàn)出一種獨特的生長能力，即在特定的固體培養(yǎng)基上可表現(xiàn)出由鞭毛介導(dǎo)的多細菌性的“霧蔓”遷徙生長能力，據(jù)報道這種能力與rsbA基因的存在及表達密切相關(guān)［14－15］。

我們從北京地區(qū)的32只腹瀉犬糞便中分離到了單一的奇異變形桿菌菌株并對其進行了系統(tǒng)的研究。在試驗中主要對其尿素酶和蛋白酶的產(chǎn)生能力、溶血能力、“霧蔓”遷徙能力進行了檢測，并且對幾種重要的毒力因子編碼基因進行了PCR檢測，以期對犬腹瀉源性奇異變形桿菌的毒力特征建立系統(tǒng)和較為深入的了解。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與生長條件 于2010年10月～2011年5月從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院患有腹瀉犬的糞便中分離得到32株奇異變形桿菌。所有菌株均通過菌落形態(tài)特征、革蘭染色、腸桿菌科細菌生化鑒定和16SrRNA基因測序鑒定而來。所有的菌株均于37℃LB肉湯或瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有的菌株均于－80℃下保存于含25%甘油的胰蛋白胨大豆（TSB）肉湯中。

1.2 細菌產(chǎn)尿素酶鑒定 將細菌接種于尿素瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)6～8h后觀察，顏色由橘黃色變?yōu)榧t色則表明產(chǎn)生尿素酶［16］。

1.3 溶血能力檢測 使用5%去纖維羊血－TSA瓊脂平板，將細菌劃線接種，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，觀察菌株的溶血情況。

1.4 細菌產(chǎn)蛋白酶檢測 細菌接種于 Mueller－Hinton肉湯中，37℃中培養(yǎng)18h后，移種于含2%脫脂牛奶的胱氨酸乳糖無電解質(zhì)瓊脂（CLED）培養(yǎng)基（內(nèi)含有50mmol/L Tris－HCl，pH 值8.0，牛奶滅菌后需無菌的混于培養(yǎng)基中），于37℃培養(yǎng)18h后觀察菌落周圍的透明情況［17］。

1.5 “霧蔓”能力檢測 奇異變形桿菌的“霧蔓”能力檢測于LB瓊脂培養(yǎng)基上進行，培養(yǎng)4h后，每小時測定菌落遷徙半徑［17－18］。

1.6 毒力基因檢測 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取32株細菌的DNA。20μL的PCR體系包含模版1μL，上下游引物各1μL，ddH2O 7μL，2×TaqMix 10μL。取5μL擴增產(chǎn)物點樣于含0.8μg/mL溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中，90V電泳30min后放于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察有無目的DNA片段。共檢測了8種毒力因子，引物序列及PCR反應(yīng)條件見表1。

表1 奇異變形桿菌毒力基因引物

2 結(jié)果

2.1 尿素酶產(chǎn)生能力 經(jīng)過培養(yǎng)后，接種所有細菌的尿素平板培養(yǎng)基均于20h內(nèi)變?yōu)榉奂t色，說明所有細菌均產(chǎn)生尿素酶，能夠分解尿素（見中插彩版圖1）。

2.2 溶血能力檢測 結(jié)果顯示，所有菌落周圍均不產(chǎn)生溶血環(huán)，32株奇異變形桿菌均為不溶血性菌株。

2.3 細菌產(chǎn)蛋白酶檢測 經(jīng)培養(yǎng)后，僅3株菌落周圍未產(chǎn)生透明圈，其他29株細菌的菌落周圍均產(chǎn)生透明圈（見中插彩版圖2）。

2.4 “霧蔓”遷徙能力檢測 在本試驗中，所有的細菌均表現(xiàn)出“霧蔓”遷徙能力（見中插彩版圖3）。不同菌株間開始遷徙的時間與速度都有較明顯的差異（圖4），遷徙能力最強的菌株其速度可達0.267cm/h，而遷徙能力最弱的菌株其速度僅為0.013cm/h。

圖4 32株奇異變形桿菌霧蔓遷徙的開始時間、平均遷徙速度

2.5 毒力基因檢測結(jié)果 PCR結(jié)果顯示，32株奇異變形桿菌均含有atfA、atfC、mrpA、pmfA、ureC基因和zapA基因，27株菌含有rsbA基因，25株菌含有ucaA基因（圖5）。圖顯示了32株奇異變形桿菌中的10株毒力基因存在情況，顯示菌株編號分別為 QL01、09、12、18、19、20、21、22、23、29。

3 討論

本試驗系統(tǒng)、專一性地研究了于犬腹瀉病例分離出的奇異變形桿菌毒力特征。Vanessa Sosa等將人源性奇異變形桿菌與1株犬源性菌株進行了毒力表型方面的比較，得出兩種源性的菌株的毒力特征沒有明顯的差異［8］。然而，Vanessa等的研究中僅收集到了1株犬源性奇異變形桿菌，因此其得出的結(jié)論需要進一步證實。同時，Gaastra等也比較了犬糞便分離的菌株與人源性菌株的毒力特征，發(fā)現(xiàn)其在菌毛的產(chǎn)生方面沒有明顯差異，并出現(xiàn)了明顯的溶血特征［7］。然而，在本試驗中，所有的菌株均未發(fā)現(xiàn)溶血特征，與先前的報道不相符。尿素酶可以水解尿素產(chǎn)生大量的氨，引起周圍環(huán)境的pH值升高，這對膀胱和腎臟結(jié)石的形成具有重要的意義，在參與尿道感染中具有重要的作用。目前，有報道顯示，所有的人源性奇異變形桿菌均可以產(chǎn)生尿素酶［20］。在本試驗中，所有的菌株均能夠產(chǎn)生尿素酶，與先前報道相符，說明其在致腹瀉毒性方面可能也起到了一定的作用，同時我們也推測，產(chǎn)尿素酶可能是奇異變形桿菌的一種普遍的毒力特征。尿素酶的編碼基因ureC也存在于所有的檢測菌株中，與毒力表型的結(jié)果完全相符。此外，本試驗通過PCR檢測到金屬蛋白酶的編碼基因zapA存在于所有的菌株中，然而蛋白酶產(chǎn)生能力測定試驗顯示有3株菌不能產(chǎn)生蛋白酶。這與Dorota等的報道較為相似，在其報道中，所有的菌株均含有金屬蛋白酶的編碼基因zapA，但是只有50%的菌株具有明顯的產(chǎn)蛋白酶的能力［18］。這種表型和基因檢測結(jié)果間的差異性可能是由部分菌株的zapA基因未能表達引起。

圖5 部分奇異變形桿菌菌株毒力基因檢測

“霧蔓”遷徙能力是奇異變形桿菌的一種非常重要的毒力特征。即在特定的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后最終呈現(xiàn)出水波狀的生長結(jié)構(gòu)；在該生長過程中，細菌可由原來的短桿菌（2～4μm）轉(zhuǎn)變?yōu)楹荛L的（＞50 μm）、多核的和高移動性鞭毛含量的長桿菌，對腎臟的感染和細菌在下泌尿道的定植具有重要作用［14］。目前，大量的研究者對其進行了較為廣泛和深入的研究。Vanessa等對人源性和犬源性菌株“霧蔓”遷徙能力的比較結(jié)果顯示，兩種菌株間的遷徙能力未有明顯的差異［8］。在本試驗中，我們也發(fā)現(xiàn)了所有菌株均具有這種特征。然而對不同菌株間的遷徙能力進行比較，結(jié)果顯示，其在不同菌株間具有明顯的差異。由于先前的報道并未對不同菌株間的“霧蔓”遷徙能力進行系統(tǒng)性的比較，因此我們只能推測這種能力可能會與菌株的致病性有著一定的相關(guān)性。rsbA基因編碼一種含有組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)移酶，是調(diào)控“霧蔓”遷徙能力的一個重要的基因，其表達量的下降會導(dǎo)致“霧蔓”能力的增強［18］。在本試驗中，共有5株菌不含有rsbA基因，其中2株具有很強的“霧蔓”遷徙能力，1株具有中等速度的遷徙能力，2株菌的遷徙能力較弱；未發(fā)現(xiàn)此基因與“霧蔓”遷徙表型間有明顯的相關(guān)性。這可能是由于“霧蔓”能力的調(diào)控除了rsbA基因外，還有很多其他的基因參與，在本試驗中僅檢測了這種基因，從而產(chǎn)生了與表型間的差異；要想更好地了解“霧蔓”表型與基因檢測間的相關(guān)性，需要進一步對其他的調(diào)控基因進行檢測。

本試驗通過對32株犬腹瀉源性的奇異變形桿菌進行毒力表型和相關(guān)毒力基因的檢測，得出了所有菌株均不具備溶血性，所有菌株均產(chǎn)生尿素酶，絕大多數(shù)菌株均具備產(chǎn)生蛋白酶的能力，所有菌株均具有“霧蔓”遷徙能力但菌株間的遷徙能力差異明顯。對這些毒力特征的掌握可以為奇異變形桿菌的致病性、傳播性和對致腹瀉模型的建立提供充分的信息和選擇。

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