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    綿羊肺腺瘤病毒內(nèi)蒙株衣殼蛋白在真核細胞中的表達

    2013-11-22 05:22:04斯日古楞么宏強馬學(xué)恩周建華
    中國獸醫(yī)雜志 2013年8期
    關(guān)鍵詞:真核質(zhì)粒載體

    斯日古楞,么宏強,馬學(xué)恩,周建華

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特010018;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,黑龍江 哈爾濱150030)

    綿羊肺腺瘤病毒(JSRV)gag基因所編碼的衣殼蛋白(CA)是JSRV的主要核心蛋白,構(gòu)成病毒粒子雙層殼的內(nèi)殼-即衣殼,具有疏水性,其氨基酸序列比較保守,在感染晚期對病毒的裝配和出芽發(fā)揮重要功能[1]。CA抗原不僅在不同毒株中高度保守,而且在病毒粒子中含量高且容易制備,因此CA蛋白一直被選作為商品化診斷抗原。

    使克隆的基因在細胞中表達在理論研究和實際應(yīng)用中都具有十分重要的意義。克隆的基因只有通過表達才能探索和研究基因的功能以及其表達調(diào)控的機理,克隆基因表達出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。為了進一步研究CA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能等奠定基礎(chǔ),本試驗中構(gòu)建其真核表達載體,實現(xiàn)了在真核細胞中的高效表達,并對表達的蛋白進行了有效鑒定。報告如下。

    1 材料

    1.1 菌株與質(zhì)粒E.coliDH5α感受態(tài)細胞、pcD-NA3.1(+)真核表達載體等,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。重組原核表達質(zhì)粒,本課題組保存。

    1.2 細胞 293細胞和Hela細胞,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

    1.3 抗體 抗HA小鼠單抗(TIANGEN);辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司);FITC標記的山羊抗小鼠IgG(Sigma公司)。

    1.4 培養(yǎng)基 DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司);優(yōu)級胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技責任有限公司);0.25%胰酶、2mmol/L L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素等均為國產(chǎn)分析純試劑。

    1.5 主要試劑 LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司);質(zhì)粒提取試劑盒 (Promega公司);PrimerSTARTMHS DNA聚合酶、5×PrimerST ARTM Buffer、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、T4DNA Ligase(寶生物工程(大連)有限公司);Western Blotting ECL超敏發(fā)光液(普利萊基因技術(shù)有限公司);LB培養(yǎng)基及其余生化試劑均為國產(chǎn)或進口的分析純試劑。

    2 方法

    2.1 重組真核表達載體的構(gòu)建 重組原核表達質(zhì)粒經(jīng)PCR法及EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定,并以其為模板,采用含HA標記序列的引物及PrimerSTARTMHS DNA高保真聚合酶進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

    膠回收純化的PCR產(chǎn)物和真核表達載體pcDNA3.1(+),雙酶切純化后,連接轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細胞,涂布于含氨芐青霉素LB平板,37℃培養(yǎng)過夜。提取的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定。陽性克隆進行核苷酸序列的測定。

    2.2 pcDNA3.1(+)-CA-HA 在真核細胞中的瞬時表達

    2.2.1 轉(zhuǎn)染真核細胞 將293細胞和Hela細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的條件下,進行貼壁培養(yǎng)2~3d后,再消化傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前在6孔板每孔鋪5×105個細胞,培養(yǎng)過夜。第2天,采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。

    2.2.2 檢測pcDNA3.1(+)-CA-HA 在真核細胞中的表達

    2.2.2.1 間接免疫熒光法檢測 將轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)至35h時,用PBS洗滌,并用預(yù)冷的無水乙醇在室溫固定20min;PBS洗滌,將一抗(HA單抗)滴加于固定細胞上,室溫孵育2h;PBS洗滌3遍,每次5min;加入FITC標記山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育1h,PBS洗滌3遍,每次5min??蛰d體轉(zhuǎn)染的細胞為陰性對照;未轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-CAHA質(zhì)粒的293細胞和Hela細胞為空白對照。倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞中熒光強度。

    2.2.2.2 Western Blotting法檢測 將轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)至18h、24h、36h和48h時,用PBS洗滌,應(yīng)用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白,進行SDS-PAGE電泳;應(yīng)用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜;廢棄封閉液,加入一抗,室溫孵育2h;用TBST洗膜3次,每次5min;再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG,室溫孵育1h;用TBST洗膜3次,每次5min;加入Western Blotting超敏發(fā)光液,用化學(xué)發(fā)光法在成像儀下曝光檢測目的蛋白的表達情況。

    3 結(jié)果

    重組真核表達載體的構(gòu)建

    3.1.1 CA-HA基因的PCR擴增結(jié)果采用PCR法以原核表達質(zhì)粒(經(jīng)PCR及雙酶切法鑒定)作為模板,進行擴增目的基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,符合預(yù)期片段大小585bp,見圖1。

    圖1 CA-HA基因的PCR擴增

    3.1.2 重組質(zhì)粒的鑒定 采用PCR、酶切法鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CA-HA,之后對陽性的重組子進行序列測定。結(jié)果顯示,目的基因序列與原序列完全一致,未發(fā)生突變,讀碼框架和插入方向完全正確。

    檢測pcDNA3.1(+)-CA-HA在真核細胞中的瞬時表達

    3.2.1 間接免疫熒光檢測結(jié)果 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞和Hela細胞35h后,用倒置熒光顯微鏡檢測,可以看到綠色熒光細胞,且熒光都位于細胞膜,對照無熒光出現(xiàn),見圖2。此結(jié)果證實所克隆的CA基因,在異源啟動子CMV的作用下,在真核細胞中可以表達,而且表達在細胞膜上。

    3.2.2 Western blotting檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染后,分別在18、24、36、48h時裂解細胞,裂解產(chǎn)物經(jīng) Westhern blotting檢測,結(jié)果顯示,在25kDa處可見特異條帶,而對照未檢測到此條帶,見圖3,說明真核表達載體pcDNA3.1(+)-CA-HA可在真核細胞中已成功表達了CA蛋白。

    圖2 間接免疫熒光方法檢測CA-HA基因在293細胞和Hela細胞中的表達

    圖3 Western blotting方法檢測在293細胞和Hela細胞中的表達

    4 討論

    JSRV的衣殼蛋白(CA)是JSRV的主要核心蛋白,構(gòu)成病毒粒子雙層殼的內(nèi)殼,它在病毒早期感染與脫衣殼過程中可以穩(wěn)定未整合的前病毒DNA[2-3],CA攜帶群特異抗原決定簇,其抗原性十分保守。反轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞后,大多數(shù)情況下不會對宿主細胞造成損害,成為隱性感染,目前該病可能發(fā)生機制是由于病毒的LTR中所含病毒轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子影響前病毒DNA插入宿主細胞,激活了宿主細胞的原癌基因,或造成抑癌基因的失活[4-5]。

    本試驗中,為了除去原核融合表達蛋白的GST標簽并獲得體外表達的具有類似天然病毒蛋白生物學(xué)活性的CA蛋白,構(gòu)建了CA基因的真核表達載體并進行真核細胞內(nèi)表達。因無相應(yīng)的抗體及陽性血清可檢測JSRVCA蛋白的表達,故在設(shè)計本試驗時CA基因中融入HA序列,以便于檢測目的基因的表達。經(jīng)酶切鑒定及測序與預(yù)期一致基因序列比較分析結(jié)果顯示,沒有發(fā)生無義突變,已成功構(gòu)建了含有CA基因的真核表達載體,并用該載體經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細胞和Hela細胞后,通過間接免疫熒光方法及 Western blotting方法檢測證實,該載體可在真核細胞內(nèi)成功表達外源性目的基因CA,在熒光顯微鏡下,轉(zhuǎn)基因陽性細胞內(nèi)外源蛋白CA廣泛分布于細胞膜上,并且 Western blotting檢測結(jié)果表明,有特異的蛋白表達。因此,可以認為本試驗所構(gòu)建的真核表達載體是成功的。本試驗對CA蛋白單克隆抗體進行初步鑒定、篩選,為建立特異性的診斷試劑盒奠定良好的基礎(chǔ)。本結(jié)果為進一步研究CA蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,以及從分子水平探討CA基因免疫等奠定了理論基礎(chǔ)。

    [1] Tustin R C,Williamson A-L,York D F.Experimental transmission of Jaagsiekte(ovine pulmonary adenomatosis)to goats[J].Onderstepoort J Vet Res,1988,50:309-316.

    [2] Brown P O.Integration of retroviral DNA[J].Curr Top Microbiol Immunol,1990,157:19-48.

    [3] Brown P O.Integration[M].In:Retroviruses(J M Coffin,S H Hughes and H E Varmus,Eds.),New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1997:161-203.

    [4] Deluca C,Kwon H,Pelletier N,etal.NF-K B protects HIV-1infected myeloid cells from apoptosis[J].Virology,1998,244:27-38.

    [5] Carlson J,Bishop J,Lyon M,etal.Chromosomal distribution of endogenous Jaagsiekte sheep retrovirus proviral sequences in the sheep genome[J].Journal of Virology,2002,75:4239-4246.

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