一種快速鑒定豬舍空氣樣品中金黃色葡萄球菌的方法

柳敦江, 王 鵬

（1.大北農(nóng)集團動物保健技術(shù)研發(fā)中心，北京 101407 ；2.南京市畜牧家禽科學(xué)研究所，南京 210036）

金黃色葡萄球菌是自然界中常見的一種革蘭氏陽性菌,其產(chǎn)生耐熱核酸酶，凝固酶，腸毒素等使其致病力很強，污染食物常引起食物中毒等，在這方面其危害僅次于沙門氏菌與溶血弧菌[1]，同時近年來，由于養(yǎng)殖環(huán)境中各種抗生素的濫用，導(dǎo)致各種耐藥金黃色萄萄球菌的產(chǎn)生，甚至出現(xiàn)了耐各類抗生素的“超級細菌”[2]。有人曾把肝炎、艾滋病與金黃色葡萄球菌并稱為世界上三大難治的傳染性頑病[3]，所以迅速采集、鑒定各個不同環(huán)境中存在的金黃色葡萄球菌，并對其做耐藥和毒力方面的研究，從而掌握各個地區(qū)金黃色葡萄球菌的耐藥性其傳播的研究至關(guān)重要 ，金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)基一般都是針對其培養(yǎng)特性而設(shè)計[4]，如高鹽甘露醇是針對其耐鹽，產(chǎn)酸的特點，而Baired-Parker 培養(yǎng)基是其鑒別培養(yǎng)基，通過抑制別的細菌生長且還原亞碲酸鹽而鑒別，而凝固酶試驗則是根據(jù)其是否產(chǎn)生凝固酶使血漿凝固而進行判斷，這些試驗都是建立在生化反應(yīng)的基礎(chǔ)之上，但是往往伴隨著假陽性與假陰性的產(chǎn)生，而且此方法耗時較長，需要3～5 d 的時間 ，并且易導(dǎo)致漏檢或檢出錯誤，常見的鑒定金黃色葡萄球菌的試驗有革蘭氏染色鏡檢，凝固酶試驗，凝集反應(yīng)等采用免疫學(xué)檢測方法如乳膠凝集試驗和ELISA，雖可縮短檢測時間，但是由于其工作原理是抗原抗體的中和反應(yīng)，因此會受到食物成分及葡萄球菌A 蛋白的影響。

顯色培養(yǎng)基的面世是對傳統(tǒng)檢測手段的一個突破，一種基于對微生物的產(chǎn)酶特性認識不斷深化而設(shè)計的一種新型培養(yǎng)基產(chǎn)品，顯色培養(yǎng)基在選擇性培養(yǎng)基中加入目標微生物特征性酶的顯色底物，將微生物的選擇性培養(yǎng)和特征性酶的測試聯(lián)合在一起。當(dāng)目標微生物在培養(yǎng)基上生長時，其特征性酶就能降解顯色底物并產(chǎn)生帶有特殊顏色的代謝物，使菌落形成特定的顏色[5]。而干擾菌或被抑制，或不產(chǎn)生特征性酶而不顯色，因而能被區(qū)別 。當(dāng)顯色培養(yǎng)基上生長菌落之后只要通過簡單的菌落顏色形態(tài)觀察或簡單試驗就能確定。

金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶是一種熱穩(wěn)定性的DNase,通常被認為是金黃色葡萄球菌的重要標志[6-7]，有國外學(xué)者研究表明耐熱核酸酶與致病性的金黃色葡萄球菌的符合率為98.3%[8]。國外已將檢測耐熱核酸酶作為致病性金黃色葡萄球菌的篩選手段，所以編碼耐熱核酸酶的基因也就成為PCR 技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的首選靶基因。通過對金黃色葡萄球菌中的nuc 基因中的保守片段設(shè)計引物進行擴增可以鑒別金黃色葡萄球菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（青島海博生物），普通營養(yǎng)瓊脂（杭州天和）。

1.1.2 測試菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923 由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)趙宏坤老師實驗室贈，表皮葡萄球菌,傷寒沙門氏菌,大腸桿菌，巴氏桿菌，糞腸球菌，鏈球菌，單增李斯特氏菌皆為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物實驗室保藏。

1.1.3 主要試劑和儀器

Andersen-6 級撞擊式空氣微生物采樣器（遼陽市醫(yī)療器械廠）。DH 4 000A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國天津市泰斯特儀器有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（ZB101 -Ⅰ型，山東淄博儀表廠）無菌超凈工作臺（AIR TECH，蘇凈集團安泰公司制造）。

1.1.4 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI 基因文庫公布的金黃色葡萄nuc 基因序列,查找到nuc 基因的序列號為V01281。

根據(jù)Brakstad 等設(shè)計的引物序列，nuc 正向5!- GCGATTGATGGTGAT ACGGTT-3′，nuc 反向5′-AGCCA AGCCTTGACGAACTAAAGC-3′，擴增257033-257311 之間的279 bp 的片段。并由大連寶生物合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集

Andersen-6 級撞擊式空氣微生物采樣器在豬場中采集空氣樣品，采樣器的放置高度為70 cm.采樣介質(zhì)為金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基。

1.2.2 樣品的培養(yǎng)

將采樣后的平皿放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察平板上生長的菌落，然后挑取藍綠色的可疑菌落接種到普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3 DNA 模板的制備

刮取普通營養(yǎng)瓊脂上生長的菌苔置于盛有150 μL 雙蒸水的1.5 mL 離心管中，放在沸水中煮沸10 min ,11 000 r/min， 離 心1 min, 取上清液，備用 。

1.2.4 反應(yīng)體系的建立

反應(yīng)液包括10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，上下游引物各1 uL，模板2 μL，雙蒸水補足50 μL。

1.2.5 擴增反應(yīng)參數(shù)

預(yù) 變 性94 ℃ 5 min，變 性94 ℃1 min，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，進行35 個循環(huán)，再72 ℃延伸5 min。

1.2.6 電泳條件

1.5%瓊脂，90 V，30～35 min.

1.2.7 確定

將檢出的陽性菌株放在API 20E 標準生化鑒定系統(tǒng)上檢測。

圖1 金黃色葡萄球菌在顯色培養(yǎng)基上的菌落圖

表1 其它對照菌在顯色培養(yǎng)基上的生長狀況及顯色效果

圖2 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2 結(jié)果分析

2.1 顯色培養(yǎng)基上的檢測結(jié)果

金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基經(jīng)恒溫培養(yǎng)24 h 后，顯現(xiàn)出藍綠色（見圖1）。

2.2 PCR 擴增產(chǎn)物特異性的檢測結(jié)果

在金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基上挑取32 株可疑菌經(jīng)過PCR 電泳后結(jié)果有28 株菌出現(xiàn)279 bp 的條帶，其與PCR的結(jié)果吻合度為84.4%（見圖2）。

2.3 標準生化鑒定系統(tǒng)檢測結(jié)果

將PCR 產(chǎn)物的陽性結(jié)果菌株經(jīng)API 20E 自動生化鑒定儀檢測后，28 株可疑菌均為金黃色葡萄球菌，而5 株陰性菌株經(jīng)測有一株為金黃色葡萄球菌，而其余四株均為雜菌。

3 結(jié)論

本研究直接從空氣中采集樣品，用金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)后，利用PCR 技術(shù) ，成功地檢測出空氣中的金黃色葡萄球菌。且檢測準確率極高。目前用傳統(tǒng)的方法來檢測金黃色葡萄球菌，費時費力，一般如果順利的話需要5～6 d 的時間，而單純的用顯色培養(yǎng)基來檢測，由于空氣中的雜菌和其他因素的影響，會產(chǎn)生較高的假陽性，而運用顯色培養(yǎng)基與PCR 方法的結(jié)合，則大大降低了金黃色葡萄球菌的檢出錯誤率，且可以大幅度地減少檢出的時間，一般從空氣采樣到檢出2 d 時間就可以完成 ，這為我們快速地檢測醫(yī)院及各種公共場合中的金黃色葡萄球菌，并且對其進一步的研究提供了便利，具有極高的潛在應(yīng)用性。

［1］ 吳仲梁，韓偉，陶軍，等．快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的檢測方法[J]．中國食品工業(yè)，2003(6)：56-57．

［2］ 姜延龍，張宇，田波，等.PCR 技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌進展[J].食品科學(xué)，2006（5）：245-249.

［3］ 張琳，李敏，于莉，等.食品中金黃色葡萄球菌檢測方法的比較研究[J].食品工業(yè)科技，2006（6）：161-164.

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