豬源乳酸桿菌齊市地方株的分離與種屬分析

邱景會(huì)

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

豬用益生菌制劑可調(diào)節(jié)豬腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，對(duì)宿主動(dòng)物產(chǎn)生益生作用。我國臨床應(yīng)用的微生態(tài)制劑菌株大概有6 種，即乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、糞鏈球菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌和酵母菌[1-2]。其中以乳酸桿菌最為常用，該菌為仔豬腸道正常微生物區(qū)系中的優(yōu)勢(shì)菌群，可利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，有的還產(chǎn)生乙酸及其他揮發(fā)性脂肪酸，對(duì)致病菌具有很好的抑制作用，對(duì)維持仔豬腸道微生物區(qū)系平衡和消化機(jī)能起著重要作用[3-4]。

由于豬的品種不同，養(yǎng)殖地域不同，優(yōu)勢(shì)菌群也有差異。選擇特異的優(yōu)勢(shì)菌株是研制豬用益生菌制劑的關(guān)鍵。所以，本研究擬從齊齊哈爾周邊地區(qū)健康仔豬腸道中分離篩選出豬源特異性乳酸桿菌，用來研制豬用微生態(tài)制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便樣品

在齊齊哈爾市龍江縣，甘南縣，富?？h及泰來縣等地區(qū)相關(guān)豬場，選定21～35 日齡長白、大白、杜洛克、二元及三元雜交健康仔豬，用滅菌棉簽蘸取新鮮糞樣，置于滅菌EP 管中，共采集糞樣15 份。送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.1.2 試劑和設(shè)備

MRS 瓊脂和MRS 肉湯（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），細(xì)菌生化鑒定管（杭州天和微生物試劑有限公司），電子天平，恒溫培養(yǎng)箱，超靜工作臺(tái)。

表1 乳酸桿菌屬鑒定結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 糞便樣品處理

將采集的仔豬糞樣置于裝有50 mL滅菌生理鹽水含玻璃珠的錐形瓶中。將錐形瓶置于搖床振蕩5 min（160 r/min），然后將原液進(jìn)行10 倍系列稀釋，自10-1至10-9，共9 個(gè)稀釋度。

1.2.2 菌株分離、染色和鏡檢

分別取10-7至10-93 個(gè)稀釋度的糞樣混懸液各0.l mL 涂布于MRS 平板，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24～48 h。挑取各種不同菌落進(jìn)行革蘭氏染色如圖1，鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

圖1 嗜酸乳桿菌革蘭氏染色圖片

1.2.3 菌株的純化

挑取疑似菌落進(jìn)行純化，記錄并觀察菌株形態(tài)特征。

1.2.4 分離菌株的生理生化鑒定

按照乳酸桿菌屬和種的生理生化鑒定指標(biāo)[5-6]，分別進(jìn)行厭氧生長試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)。若厭氧生長試驗(yàn)為陽性，其他均為陰性，可初步定為乳酸桿菌屬。再進(jìn)行糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)（阿拉伯糖、葡萄糖、葡萄糖酸鹽、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖、甘露醇、松三糖、核糖、山梨醇、蔗糖、木糖、七葉苷、水楊素），結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)照，從而進(jìn)行乳酸桿菌種的鑒定。

表2 乳酸桿菌種間生化鑒定結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)特征

通過厭氧分離純化，共獲得革蘭氏陽性，無芽孢桿菌12 株，其中菌株SY1 和SY2 菌落形態(tài)基本相同，均為圓形、邊緣不整齊、表面粗糙、扁平、灰白色菌落，菌落直徑1.0～2.0 mm；菌株DYF3 和DYF4 為圓形、邊緣整齊、表面光滑、白色菌落，菌落直徑1.0～2.0 mm。

2.2 染色特性

對(duì)分離出的所有菌株進(jìn)行了革蘭氏染色，其中12 株為革蘭氏染色陽性無芽孢桿菌，長短不一，單個(gè)、成對(duì)、個(gè)別排列呈短鏈狀。

2.3 菌株的生理生化鑒定結(jié)果

2.3.1 乳酸桿菌屬的鑒定結(jié)果

通過運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)，厭氧生長試驗(yàn)，過氧化氫酶試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)，明膠液化試驗(yàn)等7 個(gè)鑒定指標(biāo)，共5 個(gè)菌株符合乳酸桿菌屬的鑒別特征?？梢猿醪酱_認(rèn)為乳酸桿菌屬。具體結(jié)果見表1。

2.3.2 乳酸桿菌種間鑒定結(jié)果

乳酸桿菌種的鑒定主要是進(jìn)行糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)，在本研究中共應(yīng)用了15 種糖醇。其中RS1 和RS2 兩株乳酸桿菌有14 種糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸的鑒定結(jié)果符合嗜酸乳桿菌的鑒別特征，僅木糖不完全相符，可確定這2 株乳酸桿菌為嗜酸乳桿菌；菌株RS3 和RS4 僅山梨醇不完全符合植物乳桿菌鑒別特征，可確定其為植物乳桿菌；菌株RS5 僅松三糖和甘露醇不完全符合干酪乳桿菌假植物亞種鑒別特征，可確定其為干酪乳桿菌。具體結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

在齊齊哈爾周邊地區(qū)部分豬場采集的健康仔豬糞樣中，共分離得到了乳酸桿菌5 株。其中嗜酸乳桿菌2 株，植物乳桿菌2 株，干酪乳桿菌1 株。

近年來，微生態(tài)制劑在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的開發(fā)和應(yīng)用，并且促進(jìn)了養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展。國內(nèi)外眾多學(xué)者針對(duì)豬腸道益生菌的種類，生物學(xué)特性，種屬特異性已有了較深入的研究，并開發(fā)出了諸多益生菌制劑產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于臨床[7-8]。我國微生態(tài)制劑的研究和應(yīng)用起步較晚，但相對(duì)起點(diǎn)高。許多領(lǐng)域內(nèi)的大型企業(yè)已經(jīng)按照國際標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)了生產(chǎn)技術(shù)先進(jìn)、產(chǎn)能高的微生態(tài)制劑生產(chǎn)線。

然而，實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)仍有許多養(yǎng)殖戶對(duì)豬用微生態(tài)制劑的臨床應(yīng)用效果懷有質(zhì)疑。主要是因?yàn)轱曃购鬀]有達(dá)到預(yù)期效果。分析其原因：

一方面，可能與益生菌菌株特異性以及豬只生長發(fā)育階段有關(guān)系。應(yīng)根據(jù)豬只不同生長發(fā)育階段腸道益生菌菌群特點(diǎn)，研發(fā)針對(duì)仔豬各個(gè)生長階段專用的益生菌制劑產(chǎn)品[9-10]。

另一方面，雖然許多微生態(tài)制劑領(lǐng)域內(nèi)的企業(yè)已經(jīng)按照國際標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)了生產(chǎn)技術(shù)先進(jìn)、產(chǎn)能高的微生態(tài)制劑生產(chǎn)線，但在益生菌種數(shù)量、制劑活菌數(shù)及保存期和生產(chǎn)總產(chǎn)量等方面同國外產(chǎn)品還存在一定的差距。

本研究鑒定得到的5 株乳酸桿菌，均分離自齊齊哈爾周邊地區(qū)健康仔豬腸道，具有地區(qū)特異性和物種特異性。通過安全性試驗(yàn)，耐受力試驗(yàn)及發(fā)酵條件等試驗(yàn)，進(jìn)一步研究這些乳酸桿菌在不同生理環(huán)境中的特性，可篩選適合于生產(chǎn)豬源微生態(tài)制劑的乳酸桿菌菌株。為研發(fā)適用于齊齊哈爾市周邊地區(qū)的豬用益生菌制劑提供科學(xué)依據(jù)。

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