3-乙基苯并噻唑螺萘并噁嗪與牛血清白蛋白的相互作用

劉 潔，宋功武

(1. 湖北科技學院 核技術(shù)與化學生物學院，湖北 咸寧 437100； 2. 湖北大學 化學化工學院，湖北 武漢 430062)

圖1 EBSN的結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of EBSN

苯并噻唑螺萘并噁嗪是一種性能良好的光敏劑，在光照條件下形成類似部花菁同系物的開環(huán)體[1]. 有研究發(fā)現(xiàn)部花菁540、血卟啉衍生物、酞菁類化合物、金絲桃蒽酮、吩噻嗪類化合物等光敏劑，通過與脂膜、蛋白質(zhì)、核酸的結(jié)合，在光照下產(chǎn)生單線態(tài)氧和羥基自由基，對病毒引起廣泛的損傷[2]，有望用來發(fā)展血液制品病毒滅活的光化學技術(shù)[3]. 有機小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用已成為一個廣受關(guān)注的課題. 本實驗主要采用熒光法研究3-乙基苯并噻唑螺萘并噁嗪(3-ethyl-benzothiazospironaphthooxazine，EBSN，圖1)與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的作用，得到兩者的作用機理、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合過程的熱力學函數(shù)變化和主要作用力類型等，并用于樣品中BSA和EBSN含量的檢測，以期為光化學法滅活病菌的機理研究提供參考，以及為這類光敏劑的開發(fā)與應(yīng)用提供重要信息.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-540熒光光度計(日本日立公司)；PHB-4型酸度計(上海雷磁儀器廠).

BSA(華美生物技術(shù)制品公司)儲備液：用二次蒸餾水配成1.00 g·L-1，冰箱儲存；EBSN(湖北大學化學化工學院有機實驗室合成)儲備液：用5%乙醇水溶液配成1.0×10-3mol·L-1，用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，用0.1 mol·L-1NaCl溶液調(diào)節(jié)離子強度；其他所用試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水.

1.2 實驗方法

在12.5 mL比色管中依次加入適量緩沖溶液、0.1 mol·L-1NaCl溶液、BSA溶液以及EBSN溶液，用二次蒸餾水定容，混和均勻，避光保溫靜置5 min后，測定熒光光譜，測定條件為：入射狹縫和出射狹縫均為5 nm，激發(fā)波長288 nm，記錄300～525 nm范圍的熒光光譜. 通過循環(huán)水裝置保持溫度，實驗溫度分別為298, 306和310 K.

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)介質(zhì)的影響

在相同條件下，比較了不同類型的緩沖溶液，包括Tris-HCl，NaAc-HAc 和 Na2HPO4-KH2PO4，發(fā)現(xiàn)EBSN-BSA體系在Tris-HCl緩沖溶液中熒光靈敏度最高，因此選擇Tris-HCl控制溶液pH.

ρ(BSA)= 32 mg·L-1, c(EBSN) =1.6×10-5 mol·L-1圖2 pH對F0/F的影響Fig.2 The effect of pH on F0/F

2.1.2 pH的影響

固定BSA的質(zhì)量濃度和EBSN的物質(zhì)的量濃度分別為32 mg·L-1和 1.6×10-5mol·L-1，改變?nèi)芤簆H，發(fā)現(xiàn)在pH=5.5～8.0范圍內(nèi)，體系的熒光峰位置基本不變，但熒光強度變化顯著. 記錄BSA和BSA-EBSN體系的熒光強度，分別記作F0和F，作F0/F～pH曲線(圖2). 由圖2可知，pH=7.46時熒光強度變化最大，因此實驗控制溶液pH為7.46.

2.1.3 離子強度的影響

由圖3可知，離子強度大小會影響體系熒光強度的大小和穩(wěn)定性. 當加入1.4 mL 0.1 mol·L-1NaCl，即NaCl濃度為0.01 mol·L-1時，體系熒光強度變化最大且較穩(wěn)定.

2.2 體系的熒光光譜

在上述實驗條件下，當以288 nm光激發(fā)時，BSA在348 nm出現(xiàn)一個強的熒光峰，但隨著EBSN的加入，BSA的熒光強度顯著降低(圖4).在相同條件下，純的EBSN在410 nm附近有一個微弱的熒光峰，而BSA的加入使其熒光強度增強且熒光峰位紅移至427 nm. 當EBSN濃度繼續(xù)增大時，BSA的熒光繼續(xù)降低，但峰位基本不變；同時EBSN自身的熒光峰強度繼續(xù)增強，且紅移至432 nm. 兩者在412 nm有一個等發(fā)射點. 以上實驗現(xiàn)象表明，EBSN使BSA的熒光猝滅，且可能生成新的復(fù)合物[4]，但并未對BSA的構(gòu)象產(chǎn)生影響. 體系的紫外吸收光譜未發(fā)生明顯改變，也可以證明這一點. 同時BSA對EBSN的熒光有良好的增強作用，其原因可能是BSA骨架的保護使EBSN分子的自由旋轉(zhuǎn)作用降低，平面剛性作用增強，從而使其自身熒光增強.

ρ(BSA)= 32 mg·L-1, c(EBSN) =1.6×10-5 mol·L-1, pH=7.46圖3 離子強度對F0/F的影響Fig.3 The effect of ionic strength on F0/F

ρ(BSA)= 64 mg·L-1, a→f: c(EBSN)/(10-5 mol·L-1)分別為0,1.6,3.2,4.8,6.4,9.0； g為EBSN本身(1.6×10-5 mol·L-1)的熒光光譜, λex=288 nm, pH=7.46,T=298K圖4 EBSN-BSA體系的熒光光譜Fig.4 The fluorescence emission spectra of EBSN-BSA system

2.3 猝滅機理的判斷

熒光猝滅過程因猝滅機制不同主要分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[5]. 其中動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子作用使其熒光強度降低，這一過程主要依賴于擴散，因此通常隨溫度升高猝滅增強. 靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光物質(zhì)的基態(tài)分子生成不發(fā)光的復(fù)合物，從而導致熒光物質(zhì)熒光強度降低，通常隨溫度升高猝滅程度降低. 對于單一的動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅均遵循 Stern-Volmer方程：

τ0[Q]

(1)

式(1)中F0和F分別為添加EBSN前后BSA溶液的熒光強度，[Q]為游離態(tài)猝滅劑EBSN的平衡濃度. 該實驗條件下，c(BSA)在10-7mol·L-1數(shù)量級 ,c(EBSN)在10-5mol·L-1數(shù)量級，即猝滅劑遠遠過量，因此可用猝滅劑EBSN總濃度替代其平衡濃度.KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù)，單位是 L·mol-1.τ0為沒有猝滅劑時熒光分子的平均壽命，對于蛋白質(zhì)而言約為10-8s.Kq為表觀猝滅速率常數(shù)，單位為L·mol-1·s-1. 已知水溶液中猝滅劑對蛋白質(zhì)的最大擴散控制猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1[6]，則若藥物與蛋白質(zhì)的熒光猝滅過程為單一動態(tài)猝滅過程時，KSV≤2×102L·mol-1.

分別測定了三個不同溫度(T=298，306和313 K)條件下，EBSN對BSA的熒光猝滅情況. 圖5為一定濃度范圍內(nèi)不同溫度下的(F0-F)/F～[Q]關(guān)系圖. 可以看出，Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV隨溫度升高而減小，說明很可能存在靜態(tài)猝滅. 另外，不同溫度下猝滅常數(shù)均遠大于2×102L·mol-1，表明動態(tài)猝滅不是熒光猝滅的主要原因. 因此EBSN對BSA的熒光猝滅主要通過生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅來實現(xiàn).

2.4 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)

當猝滅劑小分子EBSN對BSA的熒光猝滅主要是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅時，若EBSN在BSA分子上有n個相同且獨立的結(jié)合位點，其結(jié)合常數(shù)Kb與結(jié)合位點數(shù)n可由下式求出：

(2)

由(2)式作lg [(F0-F)/F]～lg[Q]圖得圖6，依直線的斜率和截距即可求出n和Kb，計算結(jié)果列于表1. 由表1可知在298, 306和313 K時，Kb分別為1.762 0×104，3.396 3×104和6.123 5×104L·mol-1，說明EBSN與BSA之間有較強的結(jié)合作用. 不同溫度下n值均約為1，說明EBSN與BSA主要形成1∶1的加合物.

ρ(BSA)= 64 mg·L-1, c(EBSN)/(10-6 mol·L-1)分別為0, 1.6, 6.4, 12.8, 16.4, 32, 48, 64圖5 EBSN-BSA體系的Stern-Volmer曲線Fig.5 Stern-Volmer plots of EBSN-BSA system

ρ(BSA)= 64 mg·L-1, c(EBSN)/(10-6 mol·L-1)分別為1.6, 6.4, 12.8, 16.4, 32, 48, 64圖6 EBSN-BSA體系的lg [(F0-F)/F]～lg[Q]曲線Fig. 6 lg [(F0-F)/F]-lg[Q] plots of EBSN-BSA system

T/KKb/(104 L·mol-1)nΔG/(kJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K-1)ΔH/(kJ·mol-1)2981.762 00.872 8-24.213063.396 30.942 5-26.56297.0964.3273136.123 51.012 7-28.66

2.5 作用力類型的確定

通過lnK對1/T作圖，線性方程為lnK= 35.73-7 737.21/T,相關(guān)系數(shù)為0.999 77. 由曲線斜率和截距計算得熱力學常數(shù)，列于表1.

藥物與蛋白質(zhì)間的作用力屬于分子間的弱相互作用，包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水力[7]. 根據(jù)反應(yīng)前后熱力學焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型[8]：ΔH>0，ΔS>0為疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0為氫鍵和范德華力；ΔH≈0，ΔS>0為靜電引力. 由表1知該反應(yīng)是自發(fā)的(ΔG<0)，作用力主要為疏水作用力(ΔH>0，ΔS>0).

2.6 工作曲線

在最佳實驗條件下，可得出(F0-F)～ρ(BSA)曲線，線性方程為F0-F=2.439ρ(BSA)-8.322(ρ(BSA)單位為mg·L-1)，線性范圍為3.4～80 mg·L-1，線性相關(guān)系數(shù)R為0.999 6，檢出限為0.015 mg·L-1. 同時，可由(F0-F)/F～c(EBSN)曲線分析EBSN的濃度，線性方程為(F0-F)/F=0.061 89c(EBSN)+0.556 6(c(EBSN)單位為μmol·L-1)，線性范圍為6.4～25.6 μmol·L-1，線性相關(guān)系數(shù)R為0.992 8，檢出限為7.61×10-7mol·L-1.

3 結(jié)論

采用熒光光譜法研究了3-乙基苯并噻唑螺萘并噁嗪與牛血清白蛋白的作用，結(jié)果表明EBSN主要通過疏水作用力自發(fā)與BSA形成復(fù)合物，從而強烈猝滅BSA的熒光. BSA熒光強度降低的程度與EBSN的濃度有良好的線性關(guān)系.

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